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基因组特异引物和Cas12a快速检测小麦瘟病菌致病型的研究
×工程7(2021)1326研究绿色植保创新-文章利用基因组特异引物和Cas12a介导技术快速检测小麦瘟病菌致病型康厚祥a,李玉,#,叶鹏a,#,康宇华b,#,邓宇飞a,玛丽亚·贝利齐b,迪帕里·拉尼·古普塔c,努尔·乌丁·马哈茂德c,阿尔弗雷多·S.Urashimad,Sanjoy Kumar Paulc,Gary Petersone,Yilin Zhoua,周雪萍a,陶法扎勒伊斯兰教医学博士c,王国良b,a中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京100193b美国俄亥俄州哥伦布市俄亥俄州立大学植物病理学系c生物技术和遗传工程研究所,Bangabandhu Sheikh Mujibur Rahman农业大学,孟加拉国达卡dCentro de Ciências Agrárias,Universidade Federal de São Carlos,Araras,SP CEP 13600-000,Brazile美国农业部-农业研究处外国病害-杂草科学研究股(FDWSRU),佛罗里达州。关闭MD 21702,USA阿提奇莱因福奥文章历史记录:2020年3月30日收到2020年6月3日修订2020年7月20日接受2020年9月8日网上发售保留字:小麦稻瘟病小麦稻瘟病菌Cas12a核酸快速侧流免疫分析现场检测A B S T R A C T小麦稻瘟病是一种在南美和孟加拉国持续存在的毁灭性病害,由致病型稻瘟病菌(Magnaporthe magniticum由于MoT通常不能在小麦中引起视觉症状,直到抽穗期,此时感染已经进展,因此仅基于视觉症状的检测通过杀真菌剂施用进行疾病控制是无效的。为了开发一种准确、灵敏的方法来检测水稻苗期和营养生长期的稻瘟病菌,我们对来自巴西的两个稻瘟病菌分离物的基因组进行了测序,并鉴定了两个DNA片段,即MoT-6098和MoT-6099,它们存在于稻瘟病菌基因组中,但不存在于感染水稻的稻瘟病菌(Magnaporthe Magnaporthemagnesium Oryphine,MoO)致病型的基因组中。应用聚合酶链反应(PCR),我们证实了这两个标记的特异性在53 MoT和MoO分离物从南美和孟加拉国。为了测试这两个标记的效率,我们首先建立了一个环介导等温扩增(LAMP)方法,在等温条件下检测MoT,而不使用PCR机。在此之后,我们使用Cas 12 a蛋白和指导RNA( gRNA ) 来靶 向MoT-6098 和 MoT-6099 序 列。 活 化的 Cas12a 显 示出 无差 别 的单 链 脱氧 核糖 核 酸酶(ssDNase)活性。然后,我们将靶依赖性Cas12a ssDNA酶活化与重组酶聚合酶扩增(RPA)和核酸侧流免疫测定(NALFIA)相结合,以开发一种准确、灵敏且经济有效地检测感染小麦植物中的MoT特异性DNA序列的方法这种新的技术可以很容易地适用于快速检测小麦稻瘟病和其他重要的植物病害在田间。©2021 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)中找到。1. 介绍半活体营养型真菌病原菌Magnaporthe muscle(M. 这种疾病影响到许多谷物,包括两种最重要的主食作物,水稻和小麦。 稻瘟病是由M. 稻瘟病菌(MoO)致病型,近三个世纪前在中国和日本报道,现在在超过85个国家发现[1]。小麦瘟,*通讯作者。电子邮件地址:kanghouxiangcaas@163.com(H.Kang),tofazzalislam@yahoo. com(M.T. Islam),osu.edu(G.- L. Wang)。#这些作者对这项工作做出了同样的支原体引起1985年,在巴西巴拉那州的6个城市中首次鉴定出小麦(MoT)致病型[2],并且其分布逐渐在南美洲扩展到约90年代初,在3106hm2的土地上进行了造林。2016年,该病首次在南美洲以外的孟加拉国的八个地区被发现,并迅速成为小麦生产的严重威胁[4]。2017年初,多家报纸报道称,在印度-孟加拉国边境附近的印度麦田首次观察到类似小麦瘟病的症状在2016年至2019年期间,该疾病在孟加拉国共蔓延到20个地区,并继续对孟加拉国的粮食营养安全构成严重威胁。基于https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.07.0162095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页:www.elsevier.com/locate/engH.康,Y。彭,K. Hua et al.工程7(2021)13261327×········×最近的一项研究报告说,2016年在孟加拉国首次发现小麦稻瘟病的地区的农业气候条件,7印度、巴基斯坦和孟加拉国的106hm2麦田易受MoT感染[7]。保守估计产量损失5%-10%,每年潜在经济损失可能为1.32亿-2.64亿美元。因此,迫切需要采取综合办法,在孟加拉国控制这一疾病,并防止这一疾病蔓延到世界其他地区目前还不清楚MoT如何感染小麦植株,其替代宿主的身份以及有利于流行的气候因素。虽然MoT能够感染小麦植株的叶片和穗,但穗感染具有更大的经济意义。穗轴或花序梗的感染可阻断光合产物的移位,杀死穗轴的上部。在病原体有利的条件下,该疾病可导致高达100%的产量损失[8]。然而,由于穗瘟是在没有叶瘟视觉症状的田地中发生的,因此两者之间的相关性尚不清楚。因此,通过施用杀真菌剂来控制穗瘟可能是困难的,因为农民不能总是在抽穗期之前使用叶片上的病变来保证杀真菌剂的施用。此外,小麦稻瘟病也是一种种子传播性病害[9].对种子进行筛选并对它们进行MoT认证将减少疾病进一步传播到其他国家的风险。因此,开发一种快速、灵敏、低成本的方法来检测田间小麦幼苗、附近地区的替代寄主以及商业运输的小麦种子中的MoT,对于控制南美和孟加拉国的小麦稻瘟病至关重要。Pieck等人[10]鉴定了似乎是MoT菌株所特有的DNA标记。其中一个标记MoT3在284 M的DNA上表现出特异性。从几个国家收集的11个宿主物种的菌株。MoT3标记的一个360 bp片段在MoT株中扩增,而在MoO株中未扩增。然而,该片段位于编码视黄醇脱氢酶的单拷贝基因内,该基因存在于MoT、MoO和M中。黑曲霉(MoL)菌株。最近的一项研究分析了81个先前组装的Magnaporthe基因组之间的多态性,发现MoT3序列并不存在于所有MoT菌株中[11]。鉴定了一种新的DNA标记C17,其特异于小麦谱系,具有高灵敏度[11]。在定量实时(qRT)-聚合酶链反应(PCR)反应中,它成功地从研究中使用的30个小麦传播菌株中扩增了100%的DNA。然而,目前还不清楚MoT3和C17是否都是有用的快速检测MoT在受感染的小麦植株或没有在现场。近年来,开发了几种新技术,在实验室和田间条件下快速检测植物病害。例如,环介导等温扩增(LAMP)[12,13]和重组酶聚合酶扩增(RPA)[14]被广泛用于植物病害检测。值得一提的是,最近开发了一种革命性的人类疾病检测方法,该方法将Cas蛋白(如Cas 12 a和Cas 13a ) 携 带 的 可 编 程 核 苷 酸 靶 标 与 核 酸 快 速 侧 向 流 免 疫 测 定(NALFIA)方法相结合[15该方法是一种准确、快速、特异和具有成本效益的替代方法,可以很容易地适用于植物病害检测。在这项研究中,我们的目的是发展一种新的方法,快速和准确的检测MoT现场,使用RPA,Cas 12 a,和NAL- FIA。首先,我们从头测序的基因组的两个小麦稻瘟病菌株从巴西使用下一代测序(NGS)策略。其次,我们使用BLAT软件[18]在MoO和MoT基因组之间进行了成对基因序列比对分析,这导致了两个MoT特异性片段的鉴定:MoT-6098和MoT-6099。第三,我们根据MoT-6098和MoT-6099序列设计了几对引物,并验证了它们的特异性。通过PCR和LAMP检测引物的灵敏度。最后,我们将Cas12a检测方法与RPA和NALFIA技术相结合,建立了一种灵敏、低成本的小麦MoT田间检测方法。本研究为小麦稻瘟病的检测提供了一种新的方法。2. 材料和方法2.1. 真菌材料本研究所用MoO菌株(RB 22、R 01 -1、P131、Guy 11、N60、N63和N71)在中国农业科学院植物保护研究所培养。所有MoT菌株的DNA样品均在Bangabandhu Sheikh Mujibur Rahman农业大学;位于Ft.Det- rick,美国;和Centro de Ciências Agrárias,UniversidadeFed-eral de São Carlos,巴西。2.2. 本研究本研究中使用的所有引物列于表1中。2.3. 基因组测序和比较基因组分析使用Illumina测序平台(Hisep X_ten,BioMarker Co.,有限公司、中国)。简言之,将PR 01 -37.V.1和PR 01 -37.V.3的DNA随机剪切成~ 500 bp片段并克隆到测序载体中用于文库构建,然后使用Illumina系统对文库进行测序。在序列质量控制后获得干净的序列读取数据。使用SPAdes-3.13.0软件(St.俄罗斯圣彼得堡国立大学Augustus.2.5.5软件(University of Gottingen,Germany)用于MoO和MoT基因组的基因预测。然后开发了成对基因比对管道,其利用BLAT[18]作为然后通过分析两个MoT菌株(PR 01 -37.V.1和PR01 -37.V.3)和三个MoO菌株之间的全局成对基因序列比对的基因存在/不存在来鉴定潜在的MoT特异性基因。然后将潜在的特异性基因与其他MoO和MoT基因组进行比对[4,19]。具体而言,使用两步法来鉴定MoT特异性基因。首先,我们将378个候选基因与国家生物技术信息中心搜索数据库nr数据库进行比对以去除MoO基因。其次,我们将100个候选MoT基因与更多测序的MoT和MoO基因组进行比对,以测试它们是否存在于所有MoT基因组中,但不存在于所有MoO基因组中。最后,在分析中鉴定了两个MoT特异性基因。详细的生物信息学分析程序如图所示。1.一、2.4. 环介导等温扩增将LAMP反应混合物制备至终体积为100 μ L。20μ L,含有1μ L模板DNA(20μ mol L-1),2.0l mol L-1的正向和反向内部引物(FIP和BIP)、0.5l mol L-1的F3 和 B3 引 物 ( 表 1 ) 、 1 mmol L-1 的 脱 氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸(dNTP)、8 U(1 U = 16.67 nkat)的Bst DNA聚合酶(NewEngland Biolabs,USA)和1个ThermoPol反应缓冲液(20 mmolL-1的 Tris-HCL,10 mmol L-1的KCl,2 mmol L-1MgSO4,10 mmol L-1(NH4)2SO4和0.1%Triton X 10 0,pH8.8)。将混合物在65 °C保持1小时,然后通过将混合物移动至85 °C保持5分钟来终止反应。H.康,Y。彭,K. Hua et al.工程7(2021)132613280×表1本研究中使用的引物和小向导RNA(sgRNA)序列列表引物序列(从50到30)目标参考温度(℃)Mo.T6098 FACCAATATCACCTGAACGCAGACATMoT用于PCR58.4Mo.T6098 RGATTCCAGATTCACCACCAAAACAGMoT用于PCR56.4Mo.T6099 FTCTGTATTTCACACTTGGGCTTTGGMoT用于PCR57.5Mo.T6099 RAACGTCATGTAGTGCGTCTTGTTGAMoT用于PCR59.1Pot2 FCGTCACACGTTCTTCAACCMoT MoO用于PCR53.6波特2河CGTTTCACGCTTCTCCGMoT MoO用于PCR53.1Mo.T6098-SFaTTTCTGCTCGTTGGGGAGACMoT用于RT-PCR56.4Mo.T6098-SRaATGTACCCCCGTACCCATCAMoT用于RT-PCR56.3Mo.T6099-SFaATGTTGGTAACCACCGGTCCMoT用于RT-PCR56.3Mo.T6099-SRaCTTCGTATGCCTGCCGTTTGMoT用于RT-PCR56.4Pot2-SFaACGACCCGTCTTTACTTATTTGGMoT MoO用于RT-PCR54.8Pot2-SRaAAGTAGCGTTGGTTTTGTTGGATMoT MoO用于RT-PCR55.4Fam-2229-F50-[FAM-dT]CGTCACATAGGGTATATCTTTTCACAACAGssDNA对于RPA57.6小行星2229AACCTACACTCGACTCACCGCAGTTCCCCAG(THF)CGCAGTATCGTAGCCG,30,C3间隔区ssDNA对于RPA74.65B-2229-R50-生物素-TTGTCATTCGGTCTTAGAAGCACTAACTAssDNA对于RPA61.3P6098_370-gRNAAAUUUCUACUGUUGUAGAU CCGAUUUGCUGGUCGAAGGUCas12a结合对于Cas12a-Mo.T6098F3公司简介MoT用于灯54.7Mo.T6098B3ACTCGTCGGCATCTGTCAMoT用于灯55.1Mo.T6098 FIPAGCCCTGTCTCCGCTTGTGTCACCTGAAC GCAGACATCGMoT用于灯72.4Mo.T6098 BIPATGTCATTGACGGCGTCGCCTGACGTCGA TTCCCCAGTMoT用于灯72.5Mo.T6099F3CGCATCTGGAGGGGAACTMoT用于灯55.4Mo.T6099B3CTATCACCTGGCGGAGCTMoT用于灯55.2Mo.T6099 FIPAATCGGTGGCTGGCAGAGACGTCTCTGCACGGTCGAMoT用于灯73.3Mo.T6099 BIPGGTCGCTAACGTGGTGACGGTTCTCGGTG GCGAGGATGMoT用于灯72.8a用于实时PCR(RT-PCR)灵敏度测定的引物。ssDNA:单链DNA; THF:四氢呋喃; FAM-dT:与5胸腺嘧啶核苷连接的5-羧基荧光素; BIOTIN:生物素标记; SF:较短正向引物;SR:较短反向引物; FIP:正向内部引物; BIP:反向内部引物。Fig. 1.用于鉴定两个MoT特异性序列的管道。图中左上角的椭圆表示不同的M。基因组和基因1,2,3,4,. . ,N表示测序基因组中的所有预测基因。两个基因组中两个基因之间的箭头表示双向成对基因序列比对,菌株之间的拱形箭头表示两个基因组中单个基因的序列比对NR:非冗余蛋白质序列。2.5. LAMP反应产物的检测将2μ L体积的1:10稀释的SYBR Green I(10000,Invitrogen,USA)加入到LAMP产物中。变绿的反应被记录为阳性,保持棕色的反应被记录为阴性。还在用溴化乙锭染色的2%琼脂糖凝胶上分析扩增的LAMP反应。使用Gel Doc XR+ Imager系统(Bio-Rad,USA)在紫外光下对凝胶拍照。2.6. 重组酶聚合酶扩增如Piepenburg等人先前所述进行RPA。[14] 使 用 来 自 AMP-FutureBiotechCo.Ltd. 的 试 剂 盒( #WLN8203KIT ) ( 中 国 ) 。 对 于 第 一 RPA , 设 计 MoT-6098/MoT-6099特异性引物对,并添加四氢呋喃(THF)探针作为Nfoase识别位点。扩增子应含有至少一个前间区序列邻近基序( PAM ) 位 点 ( PAM 的 四 碱 基 结 构 域 ) 。“TTTA” )为Cas12a识别.为的第二RPA,H.康,Y。彭,K. Hua et al.工程7(2021)13261329≤····设计单链DNA(ssDNA)特异性引物对,并在5 0端用5-羧基荧光素(5-FAM)标记,在30端用生物素标记。对于RPA,遵循RPA试剂盒中的说明简而言之,将引物与含有重组酶、聚合酶和缓冲液的RPA溶液混合,然后将1μ L样品DNA(或Cas12a消化的溶液)加入到反应器中。然后加入制备物(总体积= 50μ L),在37-39 °C下保持2.7. ssDNA设计ssDNA设计有两个要求:①ssDNA应该很短(以便于快速PCR检测),②应该有ssDNA和靶基因组序列之间没有相同的序列。为了满足这些要求,使用计算机程序随机设计10000个120 bp的DNA序列。然后使用BLAST软件将这些120-bp序列与小麦、MoT和MoO基因组的基因组进行比对[20],并且具有E-值的序列e-10个或多于10个bp相同都被丢弃了在与小麦、MoT和MoO序列没有可检测的相似性的序列中随机选择以下序列2.8. Cas12a检测对于具有Cas12a的RPA,使用先前描述的方法[16]。Cas 12 a蛋白购自New England Bio- Labs(NEB#M0653S,USA)。简言之,将Cas12a与小向导RNA(sgRNA)(等摩尔体积)和反应缓冲液混合,并将Cas12a混合物在室温下孵育约10分钟。然后将RPA扩增的靶DNA溶液在Cas12a混合物中在37 °C下孵育约10分钟以激活Cas12a ssDNA消化活性。最后,将设计的ssDNA和活化的Cas12a蛋白组合用于ssDNA消化。2.9. 使用PCRD试纸使用Abingdon Health PCRD检测卡(#FD51673,USA)进行DNA可视化。简而言之,将5μ L来自将RPA反应物与70μ L PCRD提取缓冲液混合,并将总体积(75μ L)加入到PCRD测试盒的样品孔中。3-5 min后评估结果3. 结果3.1. 通过比较基因组学鉴定MoT特异性序列为了研究MoT和MoO之间的基因组差异,我们从两个MoT菌株PR01 -37.V.1和PR 01 - 37.V.3中提取DNA,这两个菌株是从巴西受感染的小麦植株中收集的。然后,我们使用Illumina测序平台(USA)以约150个覆盖度的基因组覆盖度对两种菌株进行重新测序。基因组组装后,我们获得了PR 01 -37.V.1的~38.5 Mb基因组序列和 PR 01 -37.V.3的~40.0 Mb基因组序列。我们还从GenBank下载了三种MoO菌株Guy11、P131和Y34的基因组序列[21]。通过成对的基因序列比对,我们确定了378个MoT基因,在三个MoO菌株中不存在。将这378个基因与GenBank蛋白质数据库(nr)进行比对,鉴定出289个与数据库中的基因具有高度同源性的基因。其中,189人有MoO基因,另外100个为MoT特异性候选基因(Appendix A中的表S1)。除了少数与细菌基因高度同源的基因外,大多数基因的命中是真菌基因,其中一半以上(100个中的57个当我们将这57个基因与其他~20测序MoT和MoO基因组[4,19],我们鉴定了两个基因,MoT-6098和MoT-6099,它们对MoT具有特异性。MoT- 6098编码推定的酸性海藻糖酶蛋白,而MoT-6099编码duf 341家族蛋白。因为MoT-6098和MoT- 6099存在于所有测序的MoT基因组中,但不存在于任何测序的MoO基因组中,所以我们选择这两个MoT特异性基因来开发MoT特异性标记。3.2. MoT-6098和 MoT-6099引物对区分MoT和MoO的灵敏度为了确定MoT和MoO菌株中MoT-6098和MoT-6099序列的特异性,我们设计了一组引物(表1中的MoT-6098 F和MoT-6098 R,以及MoT-6099 F和MoT-6099 R),并将它们用于从53种不同的M.紧张。这53个菌株收集自9个国家的14个草种(表2和表3),包括15个来自水稻的菌株、19个来自小麦的菌株和19个来自可能的替代宿主(如大麦、燕麦、狗尾草属、Bra chiaria、黑麦草属、雀麦属、牛筋草属、画眉草属、羊茅属、狗尾草属和狭叶草属)的菌株(表2和表3)。我们在Ura-shima和Islam实验室对从孟加拉国和巴西收集的25 种 菌 株 ( 表 2 ) 进 行 其 中 , 两 个禾谷镰刀菌 ( Fusariumgraminearum,F. 禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum),其引起小麦的赤霉病,分离于Urashima实验室,用于测试真菌物种之间的引物特异性。此外,我们还包括了四个来自水稻和黑麦草的菌株的DNA样品作为对照,这四个样品可在Wang实验室获得。 PCR分析表明,这两个基因在所有8个MoT菌株、一个大麦菌株和一个美国黑麦草菌株中存在,而在来自水稻、狗尾草、臂形草、燕麦和两个F.graminearum(图2和表2)。在此之后,我们测试了24 M。 保藏在USDA-ARS的Foreign Disease-Weed Science Research Unit中的菌株(表3)。除两个来自臂形草属的菌株外,其余菌株均含有这两个基因。在22个MoT阳性菌株中,11个从小麦中收集,其余的分离自MoT的替代宿主,包括在巴西、玻利维亚、巴拉圭、日本和美国收集的Lolium、Eleusine、Bromus、Eragrostis、Stenotaphrum secundatum和Festuca(Fig. 附录A和表3中的S1)。然后,我们进行了灵敏度测定,以检测两个引物对的效率将来自MoT菌株B 012 TA 301的培养物的五种浓度(0.01、0.1、1、10和50 ng/ L-1)的DNA用在具有MoT-6098 F/R和MoT-6099 F/R引物对的PCR反应中。Pot2 R/F引物对用作对照。 PCR结果表明,MoT-6099 F/R产生的DNA带具有0.1 ng/L-1DNA,而MoT-6098 F/R产生的DNA带具有10 ng/L-1DNA(图1)。 3(a))。我们还使用实时PCR测试了引物的灵敏度,使用的DNA稀释度与用于PCR的DNA稀释度相同常规的凝胶PCR。反应仅0.01ng/ L的模板DNA产生正循环阈值(Ct)值,表明通过这些引物扩增靶序列是非常敏感的(图1A和1B)。 3(b)-(d))。3.3. 感染植物中MoT的检测为了确定MoT-6098 F/R和MoT-6099 F/R引物对是否可用于检测感染小麦植株中的MoT,我们在印度Bangabandhu Sheikh MujiburRahman农业大学的生长室中,从感染MoT菌株BTJP 4 -5的小麦植株的叶片和穗中分离了DNA。H.康,Y。彭,K. Hua et al.工程7(2021)13261330表2M. 来自孟加拉国和巴西的分离株用于使用PCR 检测MoT-6098和MoT-6099片段。井号隔离主机起源Mo.T6098Mo.T6099Pot21BTGS-4-C小麦孟加拉国+a++2BTJP 4-1小麦孟加拉国+++3BTJP 4-5小麦孟加拉国+++4BTGP小麦孟加拉国+++5BTMP 182-2小麦孟加拉国+++6BTMP 1839-2小麦孟加拉国+++7BTMP 1845-3小麦孟加拉国+++8PR 01 83小麦巴西+++9CVPNO2-17-C大麦巴西+++1011RBSA 18-B-1RBCH 1814-2大米孟加拉国孟加拉国B----++12RBME 18-16-2水稻孟加拉国--+13RBME 1819-3水稻孟加拉国--+14RBDI 1831-5水稻孟加拉国--+1516RBRA 18 34-1RBRA 1836 -3水稻水稻孟加拉国孟加拉国----++1718RBTA 1847-3RBTA 1711-1水稻水稻孟加拉国孟加拉国----++1920Rb-13-BSgCCA 2a水稻膝状狗尾草孟加拉国巴西----++21公司简介小麦镰刀菌巴西--+2223FS公司简介小麦镰刀菌水稻巴西巴西----++2425BpCCA 3dTrAv01-17植物臂形草燕麦巴西巴西----++一BBN-0050公司简介水稻水稻非洲大韩民国----++CRB22水稻大韩民国--+DCL-6水稻哥伦比亚--+EPL-2黑麦草美国+++F水---一 正放大。B 负放大。表3M. 来自USDA-ARS的PCR分离物用于检测MoT-6098和MoT-6099片段。微孔编号分离株宿主来源Mo.T6098 Mo.T6099 Pot21 T-17小麦巴西+a++2BZ-45小麦巴西+++3BZ-19小麦巴西+++4T-42坦克小麦巴西+++5BZ-6小麦巴西+++6T-2小麦巴西+++7T-25小麦巴西+++8BO12TA301小麦玻利维亚+++9B-2小麦玻利维亚+++10P-13小麦巴拉圭+++11P-3-1小麦巴拉圭+++12P-28雀麦属巴拉圭+++13P-29雀麦属巴拉圭+++14EC4J牛筋草日本+++15U-203弯叶画眉草美国+++16U-199高羊茅美国+++17铀-116狗尾草美国+++18U-69多花黑麦草美国+++19S-3Setaria美国+++20U-100大狗尾草美国+++21PL-2黑麦草美国+++22A-2狭叶草美国+++23P-26臂形草属巴拉圭-b-+24P-30臂形 草 属巴拉圭--+ABN-0050非洲稻米--+BKJ 201 Rice大韩民国CRB 22 Rice大韩民国DC1 -6哥伦比亚大米--+E水-一 正放大。B 负放大。H.康,Y。彭,K. Hua et al.工程7(2021)13261331×图二. PCR检测MoT-6098和MoT-6099序列在所有供试MoT菌株中均存在,而在所有供试MoO菌株中均不存在。用(a)MoT-6098 F/R引物对、(b)MoT-6099 F/R引物对和(c)对照Pot 2F/2 R引物对扩增的MoT和MoO样品获得的凝胶(1%)的照片。DNA样品信息(凝胶中的泳道1图三.使用来自MoT菌株BO 12 TA 301的常规PCR和RT-PCR DNA进行引物对的灵敏度测定。(a)使用常规PCR的灵敏度测定。1%琼脂糖凝胶的照片来自引物组合MoT-6098 F/R、MoT-6099 F/R和Pot 2F/2 R。指出了每个DNA样品的特定稀释度和扩增子的大小(通过RT-PCR分别使用(b)MoT-6098 F/R、(c)MoT-6099 F/R和(d)Pot 2F/2 R的引物组合描绘Ct值(其中样品的荧光超过背景荧光)和DNA模板浓度的对数之间的关系引物列于表1中。R2:决定系数;y:PCR数据的线性模型孟加拉国.作为对照,我们还从自然感染的稻穗和MoT分离物BTJP 4-5和RB-13 b的MoO分离物的菌丝体中分离DNA。PCR结果表明,MoT- 6098和MoT-6099相关条带用从MoT感染的小麦叶片和穗以及MoT菌丝体获得的DNA扩增,而不是从从MoO感染的水稻叶片或MoO菌丝体分离的DNA扩增(图4)。这些结果表明,MoT-6098和MoT-6099引物可以有效地检测感染小麦植株中的MoT。3.4. 使用LAMP检测MoT由于LAMP是一种在等温条件下特异、快速和有效的DNA检测方法,我们使用LAMP 检测 MoT 中的MoT-6098和 MoT-6099扩增的DNA在琼脂糖凝胶和1000 SYBR Green染料溶液中可视化。 在琼脂糖凝胶分析中,在与来自三个MoT菌株的DNA的反应中存在扩增条带,但不存在来自五个MoO菌株的扩增条带(图1)。 5(a))。与凝胶状的吻合H.康,Y。彭,K. Hua et al.工程7(2021)13261332图四、感染小麦植株中MoT的检测(a)叶感染的早期阶段(圆圈表示播种后14天叶中的水浸损伤(b)穗感染(圆圈显示播种后105天穗颈中的灰点(c)使用琼脂糖凝胶电泳对感染的幼株和成株植物中的MoT序列进行PCR检测泳道1是DNA标记泳道。泳道2至6表示从以下样品中分离的DNA: MoT菌株BTJP 4 -5的菌丝体(泳道2)、人工接种MoT菌株BTJP 4 -5的小麦叶(泳道3)、MoT感染麦田中自然感染小麦植物的穗颈(泳道4)、MoO菌株RB-13 b的菌丝体(泳道5)和MoO感染稻田中自然感染水稻植物的穗颈(泳道6)。图五. MoT序列的LAMP检测。用含有MoT基因组DNA(样品1至3)和MoO基因组DNA(样品4至8)的八个样品(标记为1至8)进行LAMP测定。(a)LAMP扩增的基因组DNA在2%琼脂糖凝胶上可视化;凝胶的左侧和右侧分别表示用靶向MoT-6098和MoT-6099的LAMP引物获得的结果。(b)用SYBR Green染料可视化LAMP扩增的基因组DNA。左侧和右侧分别表示用靶向MoT-6098和MoT-6099的LAMP引物获得结果,用含有三种MoT菌株DNA的SYBR Green染料溶液获得绿色,但用含有五种MoO菌株DNA的溶液则没有(图5(b))。这些结果表明,LAMP可以用于快速,有效地检测MoT在等温条件下。3.5. 整合Cas12a蛋白与RPA和NALFIA技术用于现场快速检测MoT大面积无掩模光敏聚合技术在现场的应用受到限制,因为它需要高温条件(60-65 °C)。Cas12a是最近鉴定的核酸酶,其可以在靶序列的sgRNA介导的DNA结合后非特异性地消化ssDNA或单链RNA(ssRNA)[12]。基于Cas12a的序列识别特异性和ssDNA核酸酶活性,我们将该蛋白质与RPA和NALFIA技术组合用于快速MoT检测(图1A和1B)。6(a)和(b))。该过程首先使用RPA扩增MoT中的MoT特异性序列,然后将扩增产物与靶向MoT-6098和MoT-6099序列以及Cas 12 a蛋白的sgRNA一起孵育。如果MoT的DNA样品含有靶序列,则Cas12a的核酸酶活性将被激活,并且Cas12a蛋白将H.康,Y。彭,K. Hua et al.工程7(2021)13261333图六、通过整合Cas12a蛋白与RPA和NALFIA技术快速检测MoT(a)当DNA样品含有MoT-6098或MoT-6099序列时,Cas 12 a介导的检测方法(b)当DNA样品不含MoT-6098或MoT-6099序列时,Cas 12 a介导的检测方法。(c)使用MoT-6098引物对在琼脂糖凝胶上检测来自第一RPA的扩增DNA。(d)在试纸上进行第二次RPA后,NALFIA检测MoO和MoT菌株中的MoT-6098(e)使用从MoT菌株BTJP 4 -5的菌丝体(泳道1)、人工接种MoT菌株BTJP 4 - 5的小麦叶(泳道2)和在田间天然感染MoT的小麦植物的穗颈(泳道3)分离的DNA进行的MoT-6098序列的NALFIA检测CTL-:阴性对照; CTL+:阳性对照。非特异性地消化反应中随机设计的ssDNA探针然后,第二个RPA使用FAM标记的引物(左引物)和生物素标记的引物(右引物)用于ssDNA 片段,并将扩增子加载到侧向流条(PCRD )上以检测ssDNA片段。 如果MoT样品含有sgRNA靶序列,则激活的Cas12a将消化ssDNA,因此,生物素和FAM标记的ssDNA片段将不会出现在PCRD条上(图2)。 6(a))。相比之下,ssDNA将在第二次RPA中扩增,生物素和FAM标记的ssDNA条带将出现在PCRD条带上(图11)。6(b))。 我们选择了4种MoT和4种MoO菌株用于RPA和NALFIA测定,并包括用于Cas12a消化的120 bp随机设计的DNA片段(参见附录A中的实验程序)。琼脂糖凝胶分析证实了在四个MoT样品的第一RPA反应中检测到MoT-6098和MoT-6099片段,但四个MoO样品没有(图6(c))。在第二次RPA后,将反应溶液加载到PCRD条上用于NALFIA检测。 结果显示,ssDNA条带(从顶部开始的第二条条带)在所有四个MoO样品和阳性对照中清楚地明显,但在四个MoT样品或阴性对照中不明显(图1B)。 6(d))。此外,当与从MoT感染的小麦叶片分离的DNA一起使用时,NALFIA测定在人工感染的叶片和天然感染的穗中检测到MoT(图1B)。 6(e))。为了进一步测试基于Cas12a的NALFIA方法的灵敏度,我们将其与使用来自真菌菌丝体的不同浓度的DNA的常规PCR方法进行了比较(图7)。如图 7(a)和(c),当 真 菌 感 染时观察到一个周带,见图7。Cas 12 a-RPA-NALFIA介导的方法的灵敏度测定及其与传统PCR的比较。(a)PCR检测MoT-6098序列的灵敏度,使用琼脂糖凝胶上不同浓度的菌丝体模板DNA(b)PCR在琼脂糖凝胶上检测接种叶中MoT-6098序列的灵敏度(c)Cas 12 a-RPA-NALFIA介导的方法在PCRD条上检测来自菌丝体的MoT-6098序列的灵敏度。(d)Cas 12 a-RPA-NALFIA介导的方法检测PCRD条上接种叶中MoT-6098序列DPI:接种后天数H.康,Y。彭,K. Hua et al.工程7(2021)13261334··DNA浓度为0.011g/L。相比之下,基于Cas12a的NALFIA方法清楚地检测到靶序列,0.0011g/L的真菌DNA。当使用来自接种叶的DNA时,PCR在接种后4天检测到靶序列(图7(b))。然而,基于Cas12a的NALFIA方法早在接种后两天就检测到靶序列(图7(d))。这些结果表明,新的检测方法可以快速,准确,有效地识别小麦田中的MoT,从而为南美和南亚国家的毁灭性小麦稻瘟病检测提供了一个简单而经济的平台。4. 讨论随着NGS技术的发展,研究人员现在可以虽然NGS技术使研究人员能够识别密切相关的生物体之间的基因组差异,但识别特定物种或致病型所特有的序列仍然具有挑战性。为了鉴定MoT中不存在于MoO中的序列,我们对来自巴西的两种MoT菌株进行了重新测序使用成对的两步全局比对方法,我们将两种MoT菌株中的潜在不同基因与测序的MoO和MoT菌株进行比对,以鉴定MoT特异性基因。中在57个MoT特异性候选基因中,我们发现了两个在MoT和其他M.从替代宿主中收集的MoO菌株,但不在任何MoO菌株中。我们用53 M.NGS菌株证实了这一结果,并证明NGS测序与两步全局比对方法的结合能够在比较两个高度相似的基因组时快速准确地识别独特序列。为了控制作物病害,需要快速准确地诊断新发生和再发生的病害.在某些情况下,疾病控制取决于在现场立即鉴定致病病原体。自20世纪70年代以来,基于免疫的由于在常规IBD方法中使用的抗体不稳定,该方法现在使用经修饰的胶体金或其他替代颗粒,其被活化并因此被特异性抗体可视化。IBD方法的局限性在于大多数植物病原体没有特异性抗体在过去的四十年中,PCR和RT-PCR已被广泛用于检测受感染植物中的病原体DNA或RNA序列[22]。PCR方法的缺点是需要实验室配备PCR机器,并且获得诊断结果需要相对较长的时间(4相比之下,NALFIA是一种用于检测和定量复合物中分析物的纸基平台该分析的低成本和简便性导致了NALFIA在多个领域的应用扩展,包括植物病原体检测。NALFIA与核苷酸检测方法如LAMP和RPA的组合最近已成为检测植物病原体的流行方法[24]。另一种诊断方法使用Cas12a蛋白,其具有不加选择的s
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