SARS-CoV-2包膜蛋白突变对热力学性质的影响

医学信息学解锁25（2021）100675SARS-CoV-2包膜蛋白突变及其对热力学性质的影响KejieMou a，1，Mohnad Abdalla b，1，Dong Qing Wei c，d，MuhammadTahir Khan e，*，Madeeha Shahzad Lodhi e，Doaa B. Darwish f，Mohamed Sharaf g，h，Xudong Tu i，**a中国重庆市璧山医院神经外科b化学生物学教育部重点实验室，山东大学齐鲁医学院药学院药剂学系，山东省文化西路44号，250012c微生物代谢国家重点实验室，上海-伊斯兰堡-贝尔格莱德抗菌药物耐药性联合创新中心，代谢&发育科学与生命科学与生物技术学院国际联合研究实验室，上海交通大学，200030，中国d中国广东省深圳市南山区西丽街道万科云城一期8号楼鹏程实验室，邮编518055拉合尔大学分子生物学和生物技术研究所（IMBB），KM Defence Road，Lahore，Pakistan 58810f沙特阿拉伯塔布克大学理学院生物系，邮编71491g中国海洋大学海洋生命科学学院生物化学与分子生物学系，青岛，266003h埃及开罗纳赛尔城爱资哈尔大学农学院生物化学系，邮编11751i重庆医药学院，中国重庆A R T I C L EI N FO保留字：SARS-CoV-2基因组突变包膜稳定性抗病毒药物A B S T R A C T严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的结构蛋白由于在病毒生命周期中的作用而成为潜在的药物靶点。包膜蛋白（E）是一种结构蛋白，在生物体内起着重要的作用.然而，突变的出现往往导致耐药性，也可能在病毒稳定和进化中发挥重要作用。在这项研究中，我们的目的是确定E蛋白中影响蛋白质稳定性的突变。分析了大约30万个完整的全基因组序列以筛选E蛋白中的突变。使用DynaMut服务器对所有这些突变进行稳定性预测。通过分子动力学（MD）模拟100 ns的时间，在C-末端结构域，Ser 68 Phe，Pro71 Ser和Leu 73 Phe检测到的最常见的突变进行了检查。序列分析表明E蛋白存在259个突变。有趣的是，其中16个在结合宿主PALS 1蛋白的DFLV氨基酸（aa）基序（aa 72-aa 75）中检测到。均方根偏差、涨落、回旋半径和自由能图的结果表明，Ser68Phe、Pro71Ser和Leu73Phe表现出更稳定的作用。然而，可能需要更全面的实验研究来观察对病毒致病性的影响。潜在的抗病毒药物和疫苗可以在筛选基因组变异后开发使用，以更好地管理SARS-CoV-2感染。1. 介绍最近新出现的新型冠状病毒病（COVID-19）自二零一九年以来仍然是一个重大的公共卫生问题。病原体严重急性呼吸道综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）[1]正在经历许多进化阶段[2，3]，致命的病毒通过呼吸道飞沫迅速传播，影响宿主身体的重要器官[2，3]。由于冠状病毒2（CoV-2）属于以前已知的冠状病毒家族，因此它与SARS-CoV具有密切的基因组相似性。CoV-2包含ssRNA基因组[6];它编码四种结构蛋白，如刺突（S）、包膜（E）、膜（M）和* 通讯作者。拉合尔大学分子生物学和生物技术研究所KM国防路，拉合尔，58810，巴基斯坦。** 通讯作者。电 子 邮 件 地 址 ： moukejie@163.com （ K.Mou ） ， mohnadabdalla200@gmail.com （ M. Abdalla ） ， dqwei@sjtu.edu.cn （ D.Q.Wei ） ，tahirmicrobiologist@gmail.com ， imbb.uol.edu.pk （ M.T.Khan ） ， madeeha. imbb.uol.edu.pk （ M.S.Lodhi ） ， ddarwish@ut.edu.sa （ D.B.Darwish ） ，azhar.edu.eg（M.Sharaf），tX d@cqu.edu.cn（X.Tu）。1 同等贡献。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100675接收日期：2021年5月21日;接收日期：2021年7月11日;接受日期：2021年7月19日2021年7月27日在线提供2352-9148/©2021的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：www.elsevier.com/locate/imuK.某等人医学信息学解锁25（2021）1006752Fig. 1. E蛋白的结构域组织以及最常见突变的位置和频率。TM：跨膜[15]，NTD：N端结构域，CTD：C端结构域。（B）.显示通道的E蛋白的五聚体表示（C）。全长E蛋白（I-TASSER，E-QHD 43418），在环区具有最常见的突变。表1CoV-2 E蛋白中一些常见突变的频率核衣壳（N）[7]，导致16个非结构蛋白（NSP）的编码。这些结构蛋白负责病毒复制和病毒体-受体附着，因此参与致病性、病毒传播和将病毒引入宿主细胞。E蛋白由76个氨基酸组成[8]，重8[9]的文件。该蛋白具有N-末端结构域（NTD）、疏水结构域和C-末端结构域（CTD）[10]，排列为NTD前1由于疏水尾区的排列，跨膜形成离子孔在结构上，E蛋白质由七个α螺旋和八个环区域组成它形成具有35个α-螺旋区域和40个环状环区域的五聚体构型（五个分子），其由疏水尾部形成（图1B）。疏水尾的这种五聚体构型可能受到CTD内相互作用的影响[12]。这些孔作为离子通道，允许病毒穿过膜，增强其致病性[13]。E突变降低了病毒致病性，也停止了通道活性[14]，代表了一种基本的药物靶标和疫苗候选物[15]。在E蛋白序列中发现的一些新突变并不存在于现有的冠状病毒中。在CoV-2 E蛋白质序列中，精氨酸在第69位被异亮氨酸、苏氨酸和赖氨酸（R69 I、R69 T和R69 K）突变。此外，在CoV-2的氨基酸序列中，丝氨酸和苯丙氨酸分别存在于第55位和第56位，而不是苏氨酸和缬氨酸[16]。SARS-CoV-2在所有重要的靶点上都经历了许多突变[17-19 ];因此，为对抗CoV-2而开发的药物可能不是很有效。为了评估设计新型抗CoV-2抗病毒药物的药物靶点，筛选突变频率及其对重要分子热力学性质的影响至关重要。突变体靶蛋白。这对有效的野生型AA位置突变AA突变频率治疗新出现的微生物，包括SARS-CoV-2的突变体。虽然CoV-2的结构蛋白对于研究EPI_ISL_476911T9 I 168 T9 IEPI_ISL_424214S 55 F 128 S55 FEPI_ISL_538676V 62 F 129 V62 F EPI_ISL_448073S 68 Fb419bS68F EPI_ISL_452908R 69 I 159 R69 IEPI_ISL_577907 P 71 L 158 P71 L EPI_ISL_660339 P 71 Sb264bP71 S EPI_ISL_478788L 73 Fb218 bL73 Fa完整列表可在S1补充文件中获得。B 突变进行MD模拟。突变，在这项研究中，我们研究了仅存在于E蛋白中的变异，这是由于它们潜在的药物靶点。已经筛选了非常有限的信息和小规模的基因组数据用于E蛋白中的突变。这是第一个全面的研究，我们筛选了29.5万个SARS-CoV-2的完整基因组，以识别E蛋白的变体。在所有的基因组中，检测到259个突变，表现出不同程度的热力学性质。分析突变频率及其对E蛋白热力学性质的影响可能使研究人员能够设计新的抑制剂并预测致病性和传播水平。在目前的研究中，在2011年检测到的最常见的突变是图二. SARS-CoV-2的WT和MTs E蛋白的RMSD比较K.某等人医学信息学解锁25（2021）1006753=图三. SARS-COV-2 E蛋白中WT和MT的RMSF。CA：碳α。WT（橙色）和MT的RMSF。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版图四、 在不同的 模拟周期WT和MT的均方根值。WT在CTD处的表现非常不同C端（Ser68Phe、Pro71Ser、Leu73Phe）对E蛋白结构的稳定作用更强。首先，CoV-2的E蛋白存在大量的突变，可能导致其构象的改变和进化，从而导致治疗失败。其次，该病毒在不久的将来可能更具致命性，因此，针对地理特异性CoV-2毒株的抗病毒药物可能更有效。2. 方法2.1. 基因组序列检索完整的基因组是从共享所有流感数据的全球科学倡议（GISAID）（ 2019 年 12 月 至 2020 年 ） （ www.example.com ） 检 索 的https://www.gisaid.org/GISAID分享了病毒数据，以发布与公共卫生科学家相关的结果和元数据。该服务器提供各种CoV-2基因组数据，甚至包括还没有被公开我们筛选了全球报道的0.295个CoV-2基因组，用于E蛋白的变体分析。使用CoVsurver应用程序（https://www.gisaid.org/epiflu-appl/covsurver-mutations-app/）将序列与参考CoV-2基因组（登录号NC_045512）进行比对。将已鉴定的CoV-2结构蛋白突变分离并以Excel格式排列，薄膜.统计学分析筛选最常见的变异体。2.2. 结构信息科学家们都很清楚，分享SARS-CoV-2的基因组和蛋白质组数据对于更好地管理传染病以制定对策非常重要。 E蛋白结构从蛋白质数据库（PDB）[21]检索数据（PDB ID：E= 7k3g）。NTD（1-7aa）和CTD（39-75）处的一些残基在COV-2 E蛋白的PDB结构中。为了观察突变对CTD和ND末端缺失残基的影响，从I-TASSER下载全长E蛋白结构（E-QHD 43418）[22，23]。I-TASSER结构中的链ID丢失，这是在PYMOL中使用代码“sele，chain '”和“alter（sele），chain ' A '添加的。”银行MN908947）。2.3. 突变对E蛋白动态稳定性的影响记录所有观察到的突变，并使用DynaMut计算其对E蛋白结构的影响[24]。服务器K.某等人医学信息学解锁25（2021）1006754图五、MD模拟中WT和MT的SSE比较 该图通过整个蛋白质结构的残基指数报告SSE 分布，总结了模拟过程中每个轨迹帧的SSE组成。该图在一定时间段内监测每个残留物及其SSE分配。（A）WT残留指数和SSE沿Y轴在60- 65 ns MD模拟周期显示差异：（B）S68 F在40- 55 ns显示小的(C)P71 S在45- 68 ns处表现出更多的变化见图6。WT和MTs E蛋白的Rg的比较。WT（蓝色）与MT相比在整个100 ns模拟时间段内在折叠方面表现出少许差异，表明两种类型的折叠都是稳定的。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版。）实现了突变效应以及正常模式方法，可用于分析影响蛋白质稳定性和灵活性的变体。这种影响是通过基于图形的签名来衡量的，也是正常模式。 该方法优于（P 0.001）<结果也以良好的分辨率显示2.4. 分子动力学模拟如先前研究[23，24]所述，在Desmond模块（Schrodinger）上进行MD模拟。简而言之，应用TIP3P模型和Gromos 9643a1前场。用抗衡离子（NaCl）中和该体系立方简单点电荷K.某等人医学信息学解锁25（2021）1006755图7.第一次会议。 WT和MTs E蛋白的氢键。见图8。 WT和MT的稳定性和灵活性。(SPC)施加水BOX。两步（NVT和NPT）能量最小化（50000 ps），直到最小化完成。 环境压力设定为1.013巴和温度310 K为100 ns？使用均方根波动（RMSF）和均方根偏差（RMSD）分析WT（野生型）和突变体（MT）E蛋白的热力学稳定性。所有的模拟都重复了三次，以获得更好的结果。每次模拟运行约1000帧。2.5. 吉布斯自由能将MT的吉布斯自由能（G）[27]相对于野生型E蛋白作图。在恒温恒压下，G最小化到系统平衡态，即热力学势。进行主成分分析（PCA）以识别蛋白质中的低模式[28，29]。PCA简化了轨迹中复杂的运动[30-32 ]。被称为主成分（PC）的集合z1，z2. . . ， z p 是在PCA期间生成。蛋白质构象集合的能量被称为自由能景观（FEL）[33，34]。前两个分量（PC1和PC2）给出了运动的初始两个主分量上的轨迹。G值显示蛋白质的稳定性水平[353. 结果和讨论这是第一项全面的研究，其中分析了GISAID服务器（从2019年12月到2020年12月）中全球报告的29.5万个CoV-2的完整基因组序列，以识别E蛋白的变体。在来自48个国家的基因组序列中检测到大量非同义突变（259个）（补充表S1），其中最多的是来自英国的分离株（S1）。这种广泛的变异可能反映了全球范围内CoV-2毒株的变异水平。先前的研究[25，26]分别筛选了3617和81，818个COV-2基因组的E蛋白变体。这些最近的研究报告说，115个和15个非同义突变，主要存在于CTD中。3.1. 包膜（E）蛋白突变3.1.1. NTD中的突变E蛋白是CoV-2最小的结构蛋白（75个氨基酸），其所有残基NTD共检测到31个非同义突变K.某等人医学信息学解锁25（2021）1006756=-=-==-=-见图9。WT和MT残基与周围aa的相互作用。WT和MT残基的相互作用的类型是彩色编码的。S68 F、P71 S和L73 F MT与左侧WT进行了比较（补充文件S1），其中V5F（n39）、E8D（nV5I型17例，Y2H型14例。这些突变中的大多数在来自英国的分离株中检测到。NTD帮助尾区靶向高尔基复合体，使用其一些相关元件，因为该区域中的突变可能影响其效率。3.1.2. CTD中的突变在E蛋白的CTD中检测到最常见的突变（68其中一些是T91，S55F，V62F，S68F，R691，P71L，P71S和L73F（图1）。其他常见的突变已在表中列出，以及它们的残基类型和位置（表1和S1）。CTD中的突变，即S55F（128）、V62F（129）和R69I（159）可能影响病毒发病机制，改变病毒的免疫原性。E蛋白与紧密连接的结合基序的CTD显示了一些可能影响高尔基复合体处的PALS 1（与秀丽隐杆线虫Lin-7蛋白1相关的蛋白）以及CoV-2感染性的突变[38，40]。PALS1是包含突触后密度蛋白-95/椎间盘大/闭锁小带-1（PDZ）结构域的蛋白质组的成员，其参与多种细胞功能并且还充当信号蛋白的支架[28，29]。3.1.3. 跨膜（TM）结构域跨膜变体如T9I（n168）、F20 L（n90）、L21 F（n 84）、V24 M（n 76）和T30 I（n 72）可能影响E蛋白的同源五聚体构型[43]。E蛋白也可能是一个有效的药物靶标，因为它对病毒的致病性和细胞毒性有同等的贡献。它产生疏水性的病毒孔蛋白[44]。脯氨酸残基通过存在于细胞质中的疏水尾释放通过E蛋白，内质网和高尔基体区室中存在的离子梯度促进了这些病毒颗粒的分离[8]。研究E突变体以突出突变背后离子通道活性的结构变化，可能对更好地管理COVID-19非常有帮助。E蛋白的CTD含有一些常见的突变，其稳定性被预测。L73 F的DynaMut预测结果（ΔΔG：P71S （ ΔΔG ： -0.255kcal/mol ） 发 挥 去 稳 定 作 用 。 然 而 ， T9 I（ΔΔG：0.190 kcal/mol）、P71 L（ΔΔG：0.012 kcal/ mol）和S68F（ΔΔG：0.362 kcal/mol）显示出稳定作用（Sup.补充文件S1）。在C-末端检测到的最常见的突变（Ser 68 Phe，Pro71Ser和Leu 73 Phe）也通过MD模拟进行了评估，对CoV-2的E蛋白产生稳定作用。3.2. 热力学性质我们分析了CTD中存在的最常见的变体（Ser68Phe、Pro71Ser和Leu73Phe）与野生型（WT）相比与E结构稳定性3.2.1. WT和MT的RMSD和RMSF然后WT和MTs E蛋白的RMSD图显示在图1B中。 二、MTs S68F和P71S在55 ns到100 ns范围内似乎更稳定，分别为9 ns和10.5 nsRSD。WT的RMSD仍然表现出在100 ns的波动与其他MT类似，L73F在整个模拟期间也表现出稳定的偏差，到14.5美元RMSD。在80 ns-95 ns周期内，WT的RMSD为5.3 μ并且似乎仍然从95ns上升到100ns？WT和MT在灵活性方面的比较表明，K.某等人医学信息学解锁25（2021）1006757见图10。吉布斯自由能景观。刻度显示自由能值。蓝色和绿色区域比红色和黄色区域更稳定。MT S68F基于自由能景观显示出比WT更高的稳定性。WT表现出比P71S和L73F更高的稳定性。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版在某些位置的显著变化（图第3和第4段）。第53 - 75位氨基酸的RMSF在WT和MT之间表现出显著差异。该位置处的WT表现出6.89bp（55 aa）、9.88 bp（71 aa）和9.5 bp（75 aa）; S68 F表现出非常低的RMSF，对于大多数残基低于4 bp，并且在75 aa处为5.1 bp，与WT相比显著低类似地，与WT相比，P71S在CTD（5.7 μ π ι）下也表现出非常低的RMSF（图3）。与S68F类似，MT L73F与WT相比MD模拟探索了洞察力dy-分子水平上的动力学变化[45通过实验工作来实现。一些研究已报告蛋白质功能的任何变化都可能与RMSF有关[48柔性是维持蛋白质最佳功能的关键热力学特征之一[51]。这种性质的大变化可能会改变生物分子的功能。蛋白质二级结构元件（SSE），如α螺旋和β链在整个模拟过程中进行监测的差异WT和MT的SSE已在图中突出显示。20ns-70ns时5？在100ns的模拟时间内，突变引起了SSE的一些变化。在检查图5时，可以看出图5的SSE中的一些差异。 WT（图 5 A）和MT（图 5 B、C、D）可以看到。3.2.2. WT和MT蛋白质折叠稳定性的程度可以通过Rg来衡量。 Rg在一段时间内的波动表明不稳定的折叠，而直值显示稳定的折叠[52错误折叠的蛋白质显示了Rg随时间的变化（图6）。WT和MT在折叠方面表现出变化。MTS68F表现出比WT更稳定的折叠，而P71S和L73F也表现出稳定的折叠。18.9- 50 ns周期（图 6）。S68F MT的波动最小从21 ns到100 ns（1.3 nm）。Rg是原子与其共同质心之间的质量重量均方根距离。它是定义动态稳定性的重要参数，提供了一种洞察机制生物分子和总蛋白质系统的尺寸和紧凑性。针对CoV-2 E蛋白的三个MT绘制的Rg显示出比WT显著的稳定性。突变体结构显示出比WT略低的平均Rg值。3.2.3. WT和MT的氢键大部分 的相互作用 之间 的 原子主要是氢键合（HB），其有助于蛋白质折叠、稳定性，并且还参与识别。α螺旋和β折叠通过蛋白质的酰胺氮和主链的羰基氧之间的HB电位稳定[56-58 ]。蛋白质-药物相互作用中的主要力是HB、范德华力和静电力[ 51 ]。的WT和MTs CoV-2 E蛋白原子中HB的平均数显示在图7中。MT S68F表现出比P71S和P73F更少的HB。然而，两种MT（P71S和P73F）都显示出比WT更多的HB（图7），表明突变的稳定作用。P71S在前25 ns模拟期间表现出最大HB（295）。然而，对于WT和MT，在最后25ns中MD模拟中的HB的数量几乎相同突变对E蛋白稳定性和灵活性的影响如图8所示。所有MT都表现出灵活性的增加，这可能对功能产生积极影响。分子活性与柔性区域相关。根据先前的论述[59]，蛋白质需要灵活性以参与良好的催化活性。添加水可以提高灵活性，了解蛋白质灵活性的不同作用可以帮助开发包括疫苗在内的生物技术解决方案MT比WT表现出更多的相互作用。由于苯丙氨酸取代基的芳香性，S68F表现出不同的几何形状。此外，该MT中的相互作用数量似乎大于WT中的相互作用数量（图9）。在MT P71S中，脯氨酸已被取代为丝氨酸，存在于许多酶的活性位点。与S68F类似，L73F表现出更多的 相互作用（图11）。（9）与K.某等人医学信息学解锁25（2021）1006758由于其取代成芳香族氨基酸，因此与WT相比，其周围的残基具有更高的稳定性，与其周围的残基形成更多的氢相互作用，这可能有助于E稳定性。WT和MT的FEL如图10所示。最低和稳定的能量状态由蓝色表示。WT E蛋白显示出比两种MT（P71S，L73F）更稳定的状态，而MT S68F似乎比WT更稳定。蓝色区域表示稳定性，而其他区域表示蛋白质构象的转变，以达到更有利的状态。P71S、L73F中的绿色区域比WT更普遍，WT在蓝色区域附近显示稳定性。这些结果表明，E蛋白MT可能有助于引起病毒致病性[60计算G对于观察突变后的总体稳定性可能是重要的4. 结论在这项综合性研究中，259个非同义突变，在E蛋白中以不同的频率检测到。突变存在于所有三个结构域的CTD，NTD，和疏水结构域，然而，最高频率检测到的第一个。所有MT都表现出不同程度的灵活性和稳定性，其中大多数描述了灵活性和稳定性的损失。此外，三个MT（S68 F，P71 S，和L73 F）进行了分析，通过MD模拟，并表现出稳定效果的E蛋白结构。为了评估药物靶点以设计新型抗CoV-2抗病毒药物，挖掘突变频率及其对所选靶点的热力学性质的影响至关重要。这对于有效治疗包括SARS-CoV-2突变体在内的新出现的微生物尤其重要。目前的研究将大大有助于了解病毒稳定性以及CoV-2感染的进化方面和致病性，这可能有助于在不久的将来更好地管理COVID-19和开发疫苗。竞合利益所有的作者都没有利益冲突。确认作者感谢拉合尔大学IMBB教授Ahsan Sattar Sheikh的技术支持。附录A. 补充数据本 文 的 补 充 数 据 可 在 https ： //doi 网 站 上 找 到 。org/10.1016/j.imu.2021.100675。资金国 家 自 然 科 学 基 金 （ 批 准 号 ： 32070662 、 61832019 、32030063）。部分计算在鹏程实验室进行。和上海交通大学高性能计算中心。本研究也得到了重庆市教委科技攻关重点项目（kjzd-k201902802）的资助重庆市“十三五”教育科学研究计划项目（2018-GX-462 ） 。 重 庆 医 药 高 等 专 科 学 校 教 育 教 学 改 革 重 点 项 目（ CQYGZJG1909 ） 。 重 庆 医 药 高 等 专 科 学 校 人 才 引 进 项 目（ygz2016302）。作者研究的概念和设计：XT、MTK、DQW。数据采集：MTK、XT。数据分析和解释：海洋科学实验室、海洋管理实验室、海洋技术实验室。起草文章：MTK，MA，KM，DBA。修订内容：XT、KM、MSL。最终批准版本：KM、XT、DQW。引用[1] Satarker S，Nampoothiri M.严重急性呼吸综合征冠状病毒2的结构蛋白。 ArchMed Res 2020;51：482-91. https://doi.org/10.1016/j.arcmed.2020.05.012.[2] 巴嫩湖SARS-CoV-2的进化：突变综述，宿主免疫系统的作用。肾单位2021;145：392-403。https://doi.org/10.1159/000515417网站。[3] Rochman ND，Wolf YI，Faure G，Mutz P，Zhang F，Koonin EV.正在进行的SARS-CoV-2全球和区域适应性演变。118.第118章：你是谁？https://doi.org/10.1073/pnas.2104241118网站。[6] Naqvi AAT，Fatima K，Mohammad T，Fatima U，Singh IK，Singh A，et al.Insights into SARS-CoV-2 genome，structure，evolution，pathogenesis andtherapies：structural genomics approach. 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