没有合适的资源?快使用搜索试试~ 我知道了~
复杂膜蛋白的抗体疗法:优势、挑战与成功案例
工程7(2021)1541免疫学研究综述靶向复合膜蛋白的抗体疗法Georginaa德克萨斯治疗研究所,布朗基金会分子医学研究所,德克萨斯大学休斯顿健康科学中心,休斯顿,TX 77030,美国b苏州大学附属第一医院江苏省临床免疫学研究所,中国苏州215123c苏州大学江苏省临床免疫学重点实验室,苏州215123d苏州大学附属第一医院消化道肿瘤免疫学江苏省重点实验室,苏州215123苏州大学放射医学与防护国家重点实验室,苏州215123阿提奇莱因福奥文章历史记录:收到2020年2020年8月21日修订2020年11月16日接受2021年9月30日网上发售保留字:抗体疗法复合膜蛋白离子通道转运蛋白膜结合酶GPCR药物发现A B S T R A C T在分析蛋白质家族,可能作为药物的目标,膜相关的G蛋白偶联受体(GPCR)占主导地位,其次是离子通道,转运蛋白,并在较小程度上膜结合酶。然而,各种挑战将此类膜蛋白置于治疗性抗体应用的未充分利用机会的关键组中。抗体具有极高的特异性,因为它们能够靶向特定膜蛋白的特定构象,以及通过工程改造成各种抗体形式的适应性。然而,产生和分离靶向膜蛋白的特异性有效抗体的容易性取决于许多因素。特别地,当靶向具有更大的氨基酸序列独特性的更大、更简单的细胞外结构域时,特异性抗体的产生更容易这种理想条件的稀缺性通过有限数量的批准用于靶向GPCR和其他复杂膜蛋白的生物制剂来说明。开发针对复杂膜蛋白(如GPCR、离子通道、转运蛋白和膜结合酶)的抗体的挑战可以通过设计抗原、抗体生成策略、先导优化技术和抗体模式来解决。更好地了解靶向的膜蛋白将有助于基于机制的药物发现。本文综述了靶向复杂的膜蛋白与抗体的优势和挑战,并讨论了膜蛋白抗原和抗体的制备,说明选择成功的例子。©2021 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版,高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)中找到。1. 介绍根据抗体学会维护的列表,截至2021年9月,在美国或欧盟上市的抗体有127种[1]。其中,超过一半-127个中的77个-靶向膜蛋白。然而,这些抗体中的大多数靶向具有简单的跨膜结构域和大的胞外结构域(ECD)的膜蛋白,例如酪氨酸激酶受体。只有三个目标复杂的膜蛋白,特别是值得注意的是,所有获批药物中约有40%通过GPCR发挥作用;这一差异突出了靶向复杂膜蛋白的治疗性抗体的机会[2]。事实上,离子通道,*通讯作者。电子邮件地址:xueguangzh@126.com(X.- G.安志强(uth.tmc.edu,Z. An)。转运蛋白、GPCR和膜结合酶是用于药物发现的最大类别的膜蛋白[3]。业界和专注于该主题的学术团体已经发表了几篇关于靶向膜蛋白的抗体的优秀综述[2目前的审查重点是治疗性抗体的发现和开发技术的方式正在发展的可能性,抗体为基础的目标困难的膜蛋白。这类蛋白质包括GPCR、离子通道、转运蛋白和膜结合酶。GPCR和离子通道是小分子疗法最具靶向的蛋白质家族之一; 2016年对美国食品和药物管理局(FDA)批准的药物靶点的分析表明,GPCR和离子通道分别占小分子治疗效果的33%和18%[8]。然而,GPCR和离子通道已被强调为生物医学研究和临床开发的https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.11.0132095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页:www.elsevier.com/locate/engGeorginaHuang,N.Zhang等人工程7(2021)15411542[9]的文件。在开发针对复杂膜蛋白的小分子药物虽然小分子比抗体更容易到达小口袋,但抗体可以容易地靶向具有足够大ECD的复杂膜蛋白。这种复合膜蛋白的一个例子是另一个例子是Erenumab,一种靶向降钙素基因相关肽受体(CGRPR)的GPCR,被批准用于预防偏头痛[11]。可工程化性是用抗体靶向复杂膜蛋白的当蛋白质的特定构象与疾病状况相关时,抗体的优异选择性和特异性一个实例是单克隆抗体(mAb)BIL010t,其靶向离子通道P2X7(nfP2X7)的非功能构象,并且其目前处于用于治疗基底细胞癌的临床试验中[12]。与抗体缀合可以改善候选治疗剂的生物分布和药理学活性。这在一项离子通道抑制剂的研究中得到了说明,该抑制剂的半衰期大大延长,并且更好地分布到神经纤维中[13]。除了结合的直接作用之外,抗体可以通过效应子功能如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)起作用。moga-mulizumab的成功证明了效应子功能修饰用于增强治疗性抗体的前景[14]。创新结晶等结构生物学技术Niques使研究人员能够更好地理解膜蛋白[15]。为了模拟膜蛋白的天然结构而制成环状的肽增强了抗原的产生,以产生靶向这些蛋白的抗体[16]。靶向膜蛋白的治疗性抗体的分离也受益于技术进步,例如用大肠杆菌(Escherichia coli)(E. 大肠杆菌)GroEL作为分子佐剂,以产生强烈和特异性的抗体应答[17]。历史上,四个关键挑战阻碍了靶向复杂膜蛋白的抗体的开发。第一个关键挑战是分离稳定在所需构象的纯蛋白质,以用作分离抗体的抗原。第二个关键挑战是克服免疫耐受性,也就是说,生物体的免疫系统倾向于对类似于生物体自身正常蛋白质的物质无反应。因此,免疫耐受可以抑制针对这些蛋白质的大量且多样的抗体的产生。 开发针对复杂膜蛋白的治疗性单克隆抗体的第三个关键挑战是这些靶点的细胞外表位区域-抗体最可利用的区域-可以显著不同。有效地筛选分离的抗体以有效地改变其靶膜蛋白的功能是用治疗性抗体靶向复合膜蛋白的第四个关键挑战。不同的策略已被应用作为技术解决方案,以产生靶向复杂膜蛋白的抗体的挑战。 这些解决方案在释放这些潜在疗法的优势方面取得了一些成功。表1中列出了临床和临床前开发中针对复合膜蛋白的抗体治疗实例[12,18靶向复合膜蛋白的抗体的开发管道可以根据靶类别、抗原形式、抗体形成物和抗体生产平台进行有意义的分组。关于它们的配体、结合、作用机制、有效性、表位、治疗适应症和副作用,有不同程度的信息(表1)。通过抗体工程可以解决渗透挑战。如果循环中的半衰期是一个挑战,则工程化抗体的片段可结晶区(Fc)部分可用于在任一方向上改变半衰期。此外,Fc效应机制如ADCC可以通过抗体工程化来增加或减少。复杂的膜蛋白基于许多因素选择性地激活特定的信号通路。这些因子包括配体和其他相互作用的蛋白质。抗体已经显示出识别和稳定GPCR和离子通道的特定状态或构象的能力[12,41因此,这些抗体可用于使免疫调节剂的功能偏向于免疫调节剂。一个复杂的膜蛋白朝向一个优选的途径。通过检索ClinicalTrials.gov、PubMed和抗体协会编制的列表使用有代表性的例子,我们在这里讨论的抗体靶向这些复杂的膜蛋白,膜蛋白抗原的相关来源和制备,抗体生成的作用机制。2. 靶向复合膜蛋白GPCR通过在ECD处被细胞外配体激活并使用细胞内结构域将信号传递到细胞中而发挥作用[44]。离子通道通过形成一个孔来发挥作用,离子可以通过该孔穿过细胞膜的疏水核心[45]。离子通道、GPCR和其他膜结合蛋白在许多重要的细胞过程中具有活性,并且在各种疾病中也具有确定的作用。因此,它们是药理学操作的有吸引力的靶点,以促进健康功能或预防病理功能[8,9]。由于它们通常用于生物过程,并且由于它们的结构高度保守,因此针对这些靶标的治疗性干预具有高度调谐的选择性是特别重要的。这是使抗体特别有前途的治疗选择的一个标准。膜结合蛋白(如离子通道和GPCR)和膜结合酶(如基质金属蛋白酶)的结构多样性为调节这些蛋白质的特定功能的干预创造了大量机会。这种丰度也有助于对抗复杂膜蛋白的治疗性抗体的前景;抗体的复杂结构可以以多种方式进行工程改造,以匹配各种各样的靶标。抗体和GPCR的一些结构和潜在的相互作用点如图1(a)所示。抗体与GPCR相互作用的一种途径是通过稳定活性状态;例如,针对人GPR56产生作为激动性配体的抗体以分析其在人神经胶质瘤细胞中的功能[46]抗体与GPCR相互作用的第二种途径是通过促进二聚化的激动剂激活;针对代谢型谷氨酸受体7和β1-肾上腺素能受体的抗体已显示出以这种方式有效激活GPCR[47,48]。或者,抗体可充当使GPCR失活的拮抗剂。一个实例是针对葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体产生的多种拮抗性抗体的情况[49]。这些靶向GIP受体的抗体被认为有潜力作为治疗糖尿病或肥胖症患者的候选疗法。Moga-mulizumab于2018年获批用于治疗淋巴瘤Sézary综合征和蕈样肉芽肿[50]。Mogamulizumab靶向GPCRCCR 4,但尚未显示出促进其作为激动剂的活性或抑制其作为拮抗剂的活性。相反,mogamulizumab通过消耗肿瘤环境中表达CCR4的细胞(包括肿瘤细胞和调节因子)来发挥作用。GeorginaHuang,N.Zhang等人工程7(2021)15411543表1开发中的靶向膜蛋白的抗体,采用关键技术克服挑战。目标目标类抗体药物公司抗原形式抗体形式指示引用CCR4GPCRMogamulizumab/Kyowa Hakko纯化N-末端人源化糖工程化IgG 1真菌病[18-20]波泰利吉奥麒麟肽蕈样肉芽肿塞扎里CCR5GPCRPRO 140/CytoDynL1.2鼠mAb综合征移植物抗宿主病,艾滋病毒,[21-24]Leronlimab三阴性乳腺癌CGRPRGPCRErenumab/安进/可溶性N-末端人IgG2偏头痛[25-29]Aimovig诺华ECD表示为预防HEK293细胞C5ARGPCRIPH5401Innate PharmaL1.2细胞IgG癌[30个]MedImmune过表达C5aRLLCLgr5GPCRBNC-101生物学NA人源化单克隆抗体转移性[三十一]结直肠癌GPCRMCLA-158(也MerusNA来自以下组合文库的Fab结直肠[32个]靶向EGFR)重排高变VH和VL非免疫序列癌人供体GLP-1GPCR公司简介北京NA使用人IgG2 Fc糖尿病或[33个]东方片段和肽激动剂肥胖生物技术公司,公司CB1GPCR尼马西单抗鸟岩生物NANA纤维化,[34个]代谢和炎性疾病CXCR4GPCR乌洛普鲁单抗Bristol-Myers细胞过分表达人IgG4单克隆多[35]第三十五届SquibbCXCR4骨髓瘤奥拉伊-1钙安进细胞过分表达XenoMouse生产的人自身免疫[36个]释放奥拉伊-1抗体疾病激活诺和诺德胞外环状结构2人源化鼠抗体[37个]信道肽nfP2X7配体-BIL010t生物感知器区域肽IgG癌[12个]门控离子唯一暴露在信道这种P2X7变体(nfP2X7)葡萄糖转运蛋白LM043、LM048积分病毒样颗粒IgG1-FC糖尿病[38个]转运蛋白分子内开式或外-打开状态MMP-14蛋白酶膜-3A2加州大学河滨分校催化结构域来自合成人Fab的癌[39]第三十九届约束和SBPMMP-14图书馆酶医疗发现研究所人apelinGPCR公司简介安进稳定靶单域抗体来源于慢性心力[第四十届]受体纳米盘中的蛋白骆驼单重链抗体失败不适用:没有资料; CCR 5:C-C基序趋化因子受体5; C5 aR:补体成分5a受体; HEK:人胚肾; LGR 5:含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5; GLP-1:胰高血糖素样肽-1; CB1:大麻素受体1型; CXCR 4:C-X-C基序趋化因子受体4; Orai-1:钙释放激活钙通道蛋白1; EGFR:表皮生长因子受体; nfP 2X 7:非功能性P2 X嘌呤受体7; MMP-14:基质金属蛋白酶-14; IgG:免疫球蛋白G; Fc:片段可结晶区; Fab:抗原结合片段; GVHD:移植物抗宿主病; HIV:人免疫缺陷病毒; VH:可变轻链; VL:可变轻链。抑制宿主抗肿瘤反应的T细胞已证明mogamulizumab的细胞消耗作用通过Fc工程化增强的ADCC发挥作用,即去糖基化[18]。Erenumab是另一种GPCR靶向抗体,于2018 年获批用于预防成人偏头痛[11] 。Erenumab通过与配体结合竞争,作为GPCR(称为CGRPR)的拮抗剂[25,26]。抗体和离子通道之间相互作用的一种途径如图1(b)所示;抗体可以通过内化促进抑制。显示促进内化和抑制离子通道功能靶标的抗体的实例是钙释放激活的钙通道蛋白1(Orai-1)[37]。 Orai-1是一种自身免疫性疾病靶标,其形成T细胞活化所需的钙内流孔[53]。靶向特定状态是抗体可以修饰功能的另一条途径一种复杂的膜蛋白这条路径如图所示。 1(c).已经产生了靶向葡萄糖转运蛋白GLUT 4的向内开放和向外开放状态的抗体[38]。膜结合酶是另一类复杂的膜蛋白,其功能已被抗体有效地修饰,如图1(d)所示。使用关于膜蛋白结构的新的可用信息,抗体已经被工程化为具有设计成到达深层催化位点和配体结合位点的相应结构这些抗体 在 编 码 凸 互 补 位 的 重 链 ( CDR-H3 ) 上 具 有 长 互 补 决 定 区(CDR)环。这些CDR-H3取自自免疫骆驼科动物分离的抗体[40,54]或设计成模拟此类抗体的CDR-H3区[39]。蛋白酶基质金属蛋白酶-14(MMP-14)是一种癌症药物靶标,GeorginaHuang,N.Zhang等人工程7(2021)15411544Fig. 1.选择针对膜蛋白的抗体的路径。(a)抗体可以例如通过充当激动性配体或促进二聚化来激活GPCR。或者,抗体可以例如通过竞争性置换配体来阻断GPCR。(b)促进内化是抗体靶向离子通道的一种方式。(c)已经产生了针对特定功能状态的特异性抗体,在这种情况下,靶向细胞摄取葡萄糖的向内开放和向外开放状态。(d)抗体已经被设计为特异性地到达酶如MMP-14的活性位点。它们还可以通过稳定非活性构象(如CD73二聚体)来抑制酶。已被抗体通过长CDR-H3成功靶向的膜蛋白的实例[39]。另一个例子是人爱帕琳受体(APJ),其是治疗慢性心力衰竭患者的疗法的靶标[40]。JN 241 -9,据报道靶向人爱帕琳受体的抗体,尤其值得注意-这可能有两个原因:首先,APJ是A类GPCR,其具有比更频繁靶向的B类GPCR更小的N-末端ECD;其次,JN 241 -9作为激动剂起作用以替代天然APJ配体[40]。据报道,治疗性抗体MEDI 9447通过稳定酶CD 73(外-5 '-核苷酸酶)而拮抗酶CD 73(外-5GeorginaHuang,N.Zhang等人工程7(2021)15411545非活性构象和交联间CD73二聚体(图1(d))[54]。3. 抗原制剂获得调节膜蛋白功能的特异性功能性抗体始于抗原的制备。用于产生治疗性抗体的抗原理想地呈现与对靶蛋白的期望作用相关的所有表位。因此,理想的复合膜抗原呈现与所需效果相关的构象和翻译后修饰。不需要呈现整个蛋白质,但不应省略可能含有抗体靶向表位的相关结构域。可以施加改变以大量产生纯的功能活性抗原。这些改变应保留整体构象、配体结合、细胞表面表达、加工和相关表位。选择治疗性抗体的表位的策略对于不同类别的复合膜蛋白而不同。大多数情况下,表位应位于ECD环和N-末端位点[36细胞内表位可以作为揭示结构和功能的工具,例如LM043针对GLUT 4向内开放构象的细胞内环[38]。对于膜结合酶,表位可以位于抗体结合将结合的位点彼得与基板绑定[39]。表位可能位于配体结合位点,如JN 241 -9靶向爱帕琳受体的情况[40]。在某些情况下,用于产生治疗性抗体的抗原已被验证用于小分子治疗剂,其中抗体和小分子在不同表位相互作用,从而实现协同效应[21]。考虑到复杂膜蛋白的大小和复杂性,有效发现针对这些蛋白的抗体必须覆盖广泛的不同表位。抗原形式的选择由包括靶标的结构和功能的分析以及关于先前成功分离针对类似靶标的抗体的抗原形式的信息的因素指导膜蛋白靶标的亚类可以基于蛋白质执行其功能的方式来定义。例如,涉及离子通道的生理过程可以根据功能(例如刺激和分泌的偶联)分成几类GPCR的常见分类系统根据序列、功能和遗传学分析对这些蛋白质进行分组[55,56]。图2显示了选择的创新抗原形式,其使得能够成功开发针对复杂膜蛋白的治疗性mAb。抗原生成的发展,包括新型去污剂杯芳烃和鞘脂酶-脂蛋白(Salipro)颗粒的脂质纳米盘创新,最近已在其他地方进行了更全面的综述[4]。图二.选择抗原形式。(a)抗原的最简单形式是预期作为靶标的肽。如果需要,可以例如通过化学添加接头或通过环化将肽稳定为相关构象。(b)为了更天然地稳定膜蛋白的所需构象,可以使细胞表达靶膜蛋白。(c)纯化的膜蛋白可以制备为纳米盘中的抗原,其中膜支架蛋白支持细胞膜脂质环境的纳米盘模拟物。这些模拟物保留了膜蛋白的相关构象,而没有可能产生非特异性抗体的真实细胞膜的组分。(d)病毒样颗粒是另一种出于抗原目的而保留纯化的膜蛋白的天然构象的方式。(e)用编码感兴趣的膜蛋白的DNA对动物进行DNA免疫可以是有效提高对该蛋白特异性的免疫应答的策略的一部分。GeorginaHuang,N.Zhang等人工程7(2021)154115463.1. 肽肽是最简单的抗原形式,并且是最容易和最经济地大量制备的。优选肽抗原形式的三种情况是:①所需抗体仅需与受体结合的情况以消耗特定的细胞群;②受体的细胞外N-末端直接参与其功能的情况;③膜蛋白具有大ECD的情况。肽产生针对GPCR的抗体的一个成功应用涉及CCR 4[19]。肽是用于产生针对离子通道Orai-1的抗体的抗原形式之一[37]。肽可以通过被限制或环状化来稳定,以模拟天然结构[57](图2(a))。这种策略的一个例子是化学键将肽转移到支架上(CLIPS),这是一种已被广泛应用于产生针对GPCR CXC趋化因子受体-2(CXCR 2)的抗体的技术[16]。图2(a)示出了具有和不具有稳定化约束的细胞外N-末端肽,其用作抗原以产生靶向复杂膜蛋白的抗体。3.2. 表达膜肽或蛋白质的细胞脂质环境对于复杂膜蛋白的正确整合和活性仍然很重要使用并入天然结构的更复杂的抗原形式,目的是提高分离具有所需生物学功能的抗体的机会。具有治疗潜力的mAb已经通过使用表达膜肽或蛋白质的细胞[36,58]、具有诸如模拟天然膜环境的纳米盘的结构的膜蛋白[59]、其中病毒样颗粒代替天然膜的抗原形式[38,60]和编码感兴趣的膜蛋白的DNA[61,62]的免疫来产生。细胞可用于表达膜蛋白,如图2(b)所示理想情况下,表达宿主应产生高水平的功能性、正确折叠的蛋白质,并具有适当的翻译后修饰。它们还应该适应大规模的文化。大规模瞬时转染方法,如MaxCyte电穿孔系统[63],促进表达膜蛋白的细胞的分离,即使是在完全转染的细胞很少的情况下。靶向富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR 5)的mAb是使用表达膜蛋白形式的细胞成功产生的抗体的一个实例[64]。在这种情况下,受体肽与受体活性修饰蛋白(RAMP)共转染。用表达膜肽或蛋白质的细胞免疫的策略也已有效地用于产生调节离子通道功能的抗体。抑制离子通道功能的抗体已经通过免疫表达钙释放激活通道Orai-1[36]和配体门控离子通道P2X7[58]的动物而产生。Orai-1靶向用于治疗自身免疫性疾病患者[36,37]。阻断P2X7可能有助于治疗炎症性疾病患者[65]。3.3. 纯化的膜蛋白:纳米盘和SMALP历史上,洗涤剂用于从其膜纯化膜突变可用于稳定去污剂中的膜蛋白[66,67]。提供脂质环境以增强膜蛋白折叠的天然质量的要求的一种解决方案是纳米盘或脂质盘[68]。功能性爱帕琳受体APJ-激动剂抗体使用工程化版本的在昆虫细胞中表达并在纳米盘和脂质体中重构的APJ受体[40]。另一种这样的解决方案是苯乙烯马来酸脂质颗粒(SMALP)[69,70]。这是用于从膜分离膜蛋白同时保留它们的结构、功能和对于产生针对复杂膜蛋白的抗体重要的其它特征的去污剂的替代物的两个实例。从纯化的膜蛋白、脂质环境和支架蛋白制备抗原的过程如图1A所示。 2(c).3.4. 病毒样颗粒和脂蛋白体模拟天然膜的其他抗原形式包括病毒样颗粒(VLP),一种基于脂质双层的抗原形式,其更类似于天然细胞膜而不是纳米盘。这种形式的抗原与优化免疫的策略一起被用于发现靶向复杂膜蛋白(包括GPCR、离子通道和转运蛋白)的抗体[38,71,72]。VLP抗原与不同物种(即鸡)的免疫接种一起使用,以分离可用于表征GLUT 4的状态依赖性GLUT 4抗体,并用于开发抗糖尿病新疗法的研究[38]。产生病毒样脂质颗粒的过程如图1所示. 2(d).3.5. DNA免疫编码受体的DNA可以被递送到宿主体内,宿主既表达膜蛋白,又产生针对该蛋白的抗体。图2(e)说明了抗原制备的这种策略。基因枪可用于引入包被的DNA片段,以便它们将由呈递抗原的细胞表达[73,74]。选择佐剂来增强免疫反应是另一个优化的机会。DNA免疫已被用于产生激活β1-肾上腺素能受体的抗体,在互补DNA(cDNA)递送后注射稳定的受体(StaR)蛋白,以增强免疫应答[47]。共注射表达GPCR内皮素A受体(ETAR)的质粒和佐剂E。大肠杆菌GroEL对GPCR产生增强的免疫应答[17]。4. 抗体产生当研究人员研究复杂的膜蛋白作为治疗性抗体的靶点时,他们关注的主题包括靶蛋白的结构和功能、制备不同形式抗原的过程以及抗体分离的策略获得使能技术的机会有限是阻碍先导抗体从学术实验室进入临床前开发阶段的另一个障碍。用于抗体生成的技术平台涉及用于生成和维持抗体的不同来源的工具和专业知识;用于分离执行所需功能的抗体的不同方法;以及通过亲和力成熟、人源化、ADCC增强、以各种形式呈现和其他策略来优化分离的抗体。 图图3示出了用于产生优化抗体的选择平台选项。易于获得先进的抗体发现和生成技术可以帮助提高抗体分离过程的效率。这种效率又使得能够分离对困难的靶标如复杂的膜蛋白有效GeorginaHuang,N.Zhang等人工程7(2021)15411547图三.选择用于产生靶向膜蛋白的抗体的平台。一旦制备了膜蛋白抗原,其可用于产生靶向膜蛋白的抗体。从这一点出发,可以定义三个阶段用于产生优化的抗体。(a)创建不同候选抗体的来源是第一阶段。这可以通过动物免疫或构建天然或合成抗体文库来完成可以免疫野生型小鼠、靶蛋白缺陷小鼠和免疫球蛋白人源化小鼠绵羊、鸡、骆驼和美洲驼也已被免疫以成功产生靶向膜蛋白的候选治疗性抗体非人类灵长类动物是另一种选择。人供体和抗体的结构和功能分析可用于产生天然或合成抗体文库,其可克隆到载体中用于抗体表达。(b)分离是抗体生成过程的第二阶段通过筛选噬菌体文库或杂交瘤产生的抗体或从个体血浆或记忆B细胞克隆抗体基因,可以从大量候选物中分离出最有前途的先导抗体用于更大规模的生产。(c)一旦初步测定产生候选治疗性抗体的进一步细化的列表,这些抗体可以通过工程技术进一步优化,包括无岩藻糖基化和构建为不同的模式,包括IgG、Fab、单链抗体片段(scFv)、结构域抗体、双特异性抗体和具有“有效载荷”(即药物、寡核苷酸或放射性缀合物)的抗体RT-PCR:逆转录-聚合酶链反应;α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT 8)。4.1. 作为抗体来源的动物和文库:稀有抗体的分离用制备的抗原免疫动物是抗体的重要来源。动物的选择是关键。几图3(a)说明了作为抗体源用于免疫的不同动物。野生型小鼠是一种选择。通过用合成肽免疫野生型小鼠产生抗体阻断脂质激活的GPCR S1P3,称为EDD 7H9[75]。发展这项工作GeorginaHuang,N.Zhang等人工程7(2021)15411548治疗性抗体包括抑制乳腺癌肿瘤生长和控制脓毒症。如在抗原形式的讨论中提到的,Orai-1是钙释放激活的通道,其靶向用于自身免疫性疾病的管理这是通过野生型小鼠免疫产生的抗体有效靶向的蛋白质的另一个例子通过靶向Orai-1阻断T细胞功能的抗体已经通过用跨越Orai-1的第二胞外环(ECL 2)的肽免疫野生型BALB/c小鼠产生[37]。靶向Orai-1的ECL 2的抗Orai-1抗体也已通过免疫小鼠产生,所述小鼠经基因工程改造以产生人抗体[36]。在这种情况下,抗原形式是过表达Orai-1蛋白的细胞免疫动物的另一种选择是靶蛋白缺陷的小鼠。通过免疫缺乏靶蛋白的小鼠产生的抗体的一个实例是GMA 102和GMA 105,其靶向GPCR胰高血糖素样肽-1受体(GLP 1 R)。这些抗体已进入I期临床试验,用于治疗2型糖尿病(T2DM)或肥胖症患者。在这种情况下,用纯化和重折叠的人GLP 1 R N-末端ECD免疫GLP 1 R敲除小鼠[76]。随后将鼠抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)区克隆到人胚肾悬浮细胞(HEK 293 - 6 E)中,用于结构表征[77]。除了野生型小鼠和缺乏靶蛋白的小鼠之外,免疫球蛋白人源化小鼠是用于免疫的动物的选择,这种基因工程使人类抗体反应,同时保持 小 鼠 免 疫 系 统 的 功 能 [78] 。 Douthwaite 等 人 [79] 使 用VelocImmune小鼠开发了针对GPCR甲酰肽受体1(FPR 1)的治疗性mAb,以及使用噬菌体展示文库的亲和力成熟[79]。FPR1靶向治疗炎症相关疾病患者[80]。GPCR靶向抗体erenumab [25]和REMD-477 [81]使用具有掺入小鼠种系的人免疫球蛋白基因座的小鼠分离:XenoMouse平台。该平台应用的另一个实例是分离靶向钙释放激活通道Orai-1 的抗体 [36]。另一种类型的免疫球蛋白人源化小鼠Medarex KM用于产生修饰GPCR CXCR 4功能的抗体;一种称为ulocupumab的小鼠进入I期临床试验[35,82]。当产生抗困难膜蛋白的抗体来源时,考虑小鼠以外的动物的免疫是特别重要的Biosceptre公司进行了I期临床试验,用于使用针对nfP2X7的抗体治疗基底细胞癌患者,nfP2X7是三磷酸腺苷(ATP)门控钙通道P2X7的变体,通过用这种变体中唯一暴露的肽免疫绵羊而产生[12]。鸡作为在遗传学上与人类相距较远的动物,已被报道为用于产生治疗性抗体候选物的有价值的宿主[49]。骆驼科动物(包括美洲驼)是纳米抗体的来源,例如靶向CX3CR1(一种参与CD8+ T细胞募集的趋化因子受体)的抗体,用于治疗肾病患者[83]。将骆驼作为噬菌体展示抗体文库可变区的来源进行免疫,从中分离APJ激动剂抗体[40]。图3(a)还示出了人抗体和合成抗体的文库;这些是已被用作靶向困难膜蛋白的抗体来源的其他选择[38,39]。对于人类文库,遗传物质从分离自人类供体的免疫细胞中提取。对于合成文库,结构分析为遗传物质的合成然后,从提取或合成的遗传物质,扩增抗体基因并克隆到载体中,用于转染到表达宿主中无论抗体的动物来源是什么,具有所需功能的稀有抗体的分离可以通过杂交瘤或B细胞克隆来完成,如图1所示。 3(b)款。通过骨髓瘤细胞与B细胞融合产生杂交瘤,B细胞产生具有所需抗原特异性的抗体[84]。4.2. 抗体形式在分离针对困难的膜蛋白的抗体之后,可能需要克服额外的障碍以便微调那些抗体作为强大的治疗工具;图1A中示出了一些微调方法。 3( c ) .非 岩 藻 糖 基 化 抗 体 莫 加 木 利 珠 单抗使 用 通过产 生 P0TELLIGENT ®技术平台产生。敲除α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT 8)基因的细胞系[14,85]。使用不同形式的抗体是微调抗体以克服产生针对复杂或困难的膜蛋白的mAb的挑战的另一个领域。 各种形式包括IgG、抗原结合片段(Fab)、单链抗体片段(scFv)[57,71]、结构域抗体[86]、纳米抗体[49]、双特异性抗体[87]和抗体缀合物[88](图1B)。 3(c))。5. 总结这篇综述讨论了技术解决方案有助于克服针对复杂膜蛋白的治疗性抗体开发障碍的方法。这些解决方案主要存在于两个领域。制备用作抗原的复合膜蛋白是关键技术解决方案的一个领域,使得能够开发有效靶向此类蛋白的抗体。该领域关键技术解决方案的第二个领域涉及抗体优化和生产技术平台。抗体相对于小分子和肽类药物具有许多独特的优势;复杂的膜蛋白在正常和疾病状态中发挥广泛的作用。因此,许多研究小组和公司正致力于开发靶向复杂膜蛋白的治疗性抗体这个概述的一个局限性是,在这个领域有太多的新发展,这里无法涵盖所有的事情本综述中提供的选择是基于我们对治疗性抗体开发的理解和经验的该领域状态的代表性快照。未来改进的一个领域包括制定指导方针,为给定靶标提供抗原形式和抗体生成平台的最佳选择另一个需要改进的领域是开发用于选择目标复合膜蛋白的指南筛选是开发治疗性抗体的另一个步骤,其中获得技术可以发挥重要作用。结合测定和亲和力测量通常是第一步,并且体外和体内抗体的验证是接下来的步骤。功能性测定取决于靶标、靶标的期望变化以及抗体旨在进行该变化的机制。例如,为了实现钙释放激活通道Orai-1的抑制,其靶向降低自身免疫性,用于筛选的体外抗体功能测定包括钙通量测定、电流测量、评估GeorginaHuang,N.Zhang等人工程7(2021)15411549抗体对T细胞活化的影响,以及细胞因子释放测定[36,37]。体内抗Orai-1抗体抑制功能的测定涉及人源化GVHD小鼠模型中移植物抗宿主病(GVHD)症状的表征[37]。对结构的洞察是设计能够发现人爱帕琳受体激动剂抗体JN 241 -9的策略的关键。该受体抗体激活的功能筛选包括检测细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平和b-抑制蛋白募集试验[40]。针对β1-肾上腺素能受体的激动剂抗体的功能筛选涉及用于评估cAMP刺激的基于细胞的测定和用于测量通过β-抑制蛋白的信号传导的酶片段互补测定。大麻素受体1型(CB1)受体激动剂抗体的功能筛选也使用cAMP功能测定[89]。通过评估刺激糖原合成酶激酶3(GSK-3)磷酸化能力的功能筛选,检测针对缓激肽B2受体(BKB 2 R)的激动剂活性[90]。现有技术和专业知识的进步已经使得靶向复杂膜蛋白的治疗性抗体的产生、分离、筛选和工程化取得了重大这些产品和即将到来的进展的应用将使复杂的膜蛋白在不久的将来更有针对性。致谢这项工作得到了美国德克萨斯州癌症预防和研究所(PR 150551和RP 190561)和韦尔奇基金会(AU-0042-20030616)的部分支持国家自然科学基金(31700778、31320103918)和江苏省遵守道德准则Georgina引用[1] 在欧盟或美国获批或正在接受监管审查的抗体治疗剂[互联网]。Frafiction:抗体学会;2015[引用2021年9月16日]。可从https://www.antibodysociety.org/resources/approved-抗体/获得。[2] Hutchings CJ,Koglin M,Olson WC,Marshall FH.针对G蛋白偶联受体的治疗性抗体的机会。Nat Rev Drug Discov2017;16(11):787-810。[3] HutchingsCJ , Colussi P , Clark TG. 离 子 通 道 作 为 治 疗 性 抗 体 靶 点 。 MAbs2019;11(2):265-96。[4] 多德RB,威尔金森T,斯科菲尔德DJ。针对复杂膜蛋白靶点的治疗性单克隆抗体:抗原生成和抗体发现策略。BioDrugs2018;32:339-55.[5] Douthwaite JA,Finch DK,Mustelin T,Wilkinson TC. G蛋白偶联受体和离子 通道 治 疗 性抗 体 的开 发 : 机 遇、 挑 战 及 其在 呼 吸系 统 疾 病中 的 治 疗潜 力Pharmacol Ther2017;169:113-23.[6] Wilkinson TC,Gardener MJ,Williams WA.离子通道靶向功能抗体的发现。JBiomol Screen 2015;20(4):454-67.[7] 吴伟杰,王晓刚,王晓刚,王晓刚. 抗体和毒液肽:离子通道的新模式。Nat RevDrug Discov2019;18(5):339-57。[8] Santos R , Ursu O , Gaulton A ,Bento AP , Donadi RS , Bologa CG , et al.Acomprehensive map of molecular drug targets. Nat Rev Drug Discov 2017;16(1):19-34.[9] [10] J.J. M,J. S,J. S,J. S,et al. 人类基因组中未开发的治疗机会。Nat RevDrugDiscov 2018;17(5):317-32。[10] Kasamon YL,Chen H,de Claro RA,Nie L,Ye J,Blumenthal GM,et al.FDA批准摘要:mogamulizumab-kpkc用于蕈样肉芽肿和Sézary综合征。临床癌症研究2019;25(24):7275-80。[11] ShreiberAM. Erenumab(Aimovig)用于成人偏头痛预防 美国家庭医生2019;99(12):781-2。[12] GilbertSM,Gidley Baird A,Glazer S,Barden JA,Glazer A,Teh LC,等. 一项I期临床试验表明,nfP2X7靶向抗体为基底细胞癌提供了一种新的、安全的和可耐受的局部治疗。英国皮肤病学杂志2017;177(1):117-24。[13] Biswas K , Nixey TE , Murray JK , Falsey JR , Yin L , Liu H 等 ,Engineeringantibody reactivity for efficient derivatization to generate Na V1.7inhibitoryGpTx-1 peptide-antibody conjugates.ACS Chem Biol 2017;12(9):2427-35。[14] Beck A , Reichert JM. mogamulizumab 的 上 市 批 准 : 糖 工 程 的 胜 利 。MAbs2012;4(4):419-25。[15] Weierstall U,James D,Wang C,White TA,Wang D,Liu W,et al. Lipidiccubicphaseinjectorfacilitatesmembraneproteinserialfemtosecondcrystallography. Nat Commun2014;5(1):3309.[16] Boshuizen RS,Marsden C,Turkstra J,Rossant CJ,Slootstra J,Copley C,et al. 一种体外技术组合,用于有效发现抗人CXC趋化因子受体-2(CXCR 2)的功能性单克隆抗体。 MAbs 2014;6(6):1415-24。[17] [10] FujimotoA,Koamoto N,Hasegawa H,Suzuki H,Sugano S,Chiba J. 使用E. coliGroEL作为DNA免疫的分子佐剂。J Immunol Methods 2012;375(1-2):243-51.[18] Ito A , Ishida T , Utsunomiya A , Sato F , Mori F , Yano H , et al.Defucosylatedanti-CCR4
下载后可阅读完整内容,剩余1页未读,立即下载
cpongm
- 粉丝: 5
- 资源: 2万+
上传资源 快速赚钱
- 我的内容管理 展开
- 我的资源 快来上传第一个资源
- 我的收益 登录查看自己的收益
- 我的积分 登录查看自己的积分
- 我的C币 登录后查看C币余额
- 我的收藏
- 我的下载
- 下载帮助
最新资源
- ExtJS 2.0 入门教程与开发指南
- 基于TMS320F2812的能量回馈调速系统设计
- SIP协议详解:RFC3261与即时消息RFC3428
- DM642与CMOS图像传感器接口设计与实现
- Windows Embedded CE6.0安装与开发环境搭建指南
- Eclipse插件开发入门与实践指南
- IEEE 802.16-2004标准详解:固定无线宽带WiMax技术
- AIX平台上的数据库性能优化实战
- ESXi 4.1全面配置教程:从网络到安全与实用工具详解
- VMware ESXi Installable与vCenter Server 4.1 安装步骤详解
- TI MSP430超低功耗单片机选型与应用指南
- DOS环境下的DEBUG调试工具详细指南
- VMware vCenter Converter 4.2 安装与管理实战指南
- HP QTP与QC结合构建业务组件自动化测试框架
- JsEclipse安装配置全攻略
- Daubechies小波构造及MATLAB实现
资源上传下载、课程学习等过程中有任何疑问或建议,欢迎提出宝贵意见哦~我们会及时处理!
点击此处反馈
安全验证
文档复制为VIP权益,开通VIP直接复制
信息提交成功