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医学信息学解锁20(2020)100394SARS-CoV-2候选疫苗的计算机克隆及验证ManojitBhattacharya a,b,1,Ashish Ranjan Sharma a,1,Prasanta Patra b,Pratik Ghosh b,Garima Sharma c,Bidhan Chandra Patra b,Rudra P. Saha d,Sang-Soo Lee a,**,Chiranjib Chakrabortya,d,*a韩国江原道春川市24252 Hallym大学春川圣心医院骨老化整形外科研究所bVidyasagar University,Midnapore,721 102,West Bengal,Indiac大韩民国江原道国立大学药学院神经精神药理学和毒理学方案d印度西孟加拉邦加尔各答Barasat-Barrackpore路阿达马斯大学生命科学与生物技术学院生物技术系,邮编700126A R T I C L EI N FO保留字:SARS-CoV-2COVID-19表位疫苗致敏性炎症反应A B S T R A C TSARS-CoV-2在全球范围内迅速蔓延。为了控制其传播并防止进一步的死亡,开发针对SARS-CoV-2的疫苗是一个紧迫的先决条件。因此,在这篇文章中,通过利用计算机模拟方法,已经提出了针对SARS-CoV-2的候选疫苗。此 外 , 我 们 提 出 的 候 选 表 位 疫 苗 的 有 效 性 和 安 全 性 措 施 已 通 过 计 算 机 模 拟 工 具 和 服 务 器 ( AllerTOP 和AllergenFP服务器)进行了评价。我们观察到,候选疫苗没有过敏性,并成功地与Toll样受体(TLR)蛋白结合,引发炎症免疫反应。通过正态模式分析证实了疫苗-TLR蛋白结合界面的稳定的功能移动性。计算机克隆模型证明了构建疫苗的功效以及针对SARS-CoV-2的鉴定的表位。综上所述,我们提出的计算机模拟候选疫苗对COVID-19感染具有强大的疗效,后续的研究工作可能会在体外和体内模型中验证其有效性1. 介绍新型冠状病毒感染COVID-19的流行病学首先在中国武汉市报告,其后,随着大流行性质,其已迅速蔓延至中国及其他国家。2020年1月30日,世界卫生组织(WHO)宣布,鉴于该疾病的快速爆发,发生了国际关注的突发公共卫生事件[1]。迄今为止,世卫组织共报告了10,719,946例确诊病例和517,337例死亡。感染患者出现发热、咳嗽、疲劳、肌痛、呼吸困难、白细胞计数下降等症状[2这种疾病的既定传播模式是通过以下任何方式的身体接触:咳嗽,打喷嚏和呼吸道飞沫[5这种病毒,严重急性呼吸道综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2),以前被称为新型冠状病毒(2019-nCoV),是COVID-19病原体鉴定[8它是一种包膜病毒,由正链RNA作为基因组组分[11]。该病毒具有冠状外观的特征,这是由于刺突糖基化,病毒包膜上的蛋白质[12]。刺突糖蛋白由于其外表面定位,可能成为药物设计、疫苗开发和免疫治疗的所有选择的表位都在人免疫框架模型中预测或验证。这种方法可以为设计和开发针对SARS-CoV-2的候选疫苗提供实用的方法。最初,所需抗原的选择或将特定蛋白质视为免疫原是一项具有挑战性的工作。因此,基于表位的疫苗设计、计算机克隆和验证可以允许在给定的时间范围内评价特定疫苗的新颖性和有效性。最近, 我们 有 提出 一个 基于表位 计算机模拟肽缩略语:SARS-CoV-2,严重急性呼吸综合征冠状病毒2型; NMA,正态模式分析; TLR,Toll样受体; ACC,自动交叉变异; CAI,密码子适应指数。* 通讯作者。印度西孟加拉邦加尔各答Jagannathpur Barasat-Barrackpore Rd,Adamas大学生命科学与生物技术学院生物技术系,** 通讯作者。电子邮件地址:totalhip@hallym.ac.kr(S.-S. Lee),drchiranjib@yahoo.com(C.Chakraborty)。1作者对这项工作作出了同样的https://doi.org/10.1016/j.imu.2020.100394接收日期:2020年5月18日;接收日期:2020年7月5日;接受日期:2020年7月5日在线预订2020年2352-9148/©2020的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页:http://www.elsevier.com/locate/imuM. Bhattacharya等人医学信息学解锁20(2020)1003942表1显示遇到MHC-I和MHC-II等位基因的表位的列表。SARS-CoV-2疫苗[13]。在此,我们试图执行这些鉴定的表位的计算机SL.没有表位遭遇MHC-I等位基因SL.号遇到MHC-II等位基因的表位对过敏性的理解是任何疫苗安全性和有效性的必要条件。因此,我们分析了1SQCVNLTTR 1 IHVSGTNGT2GVYYHKNNK 2 VYYHKNNKS3GKQGNFKNL 3 FKNHTSPDV4GIYQTSNFR5VSPTKLNDL6KIADYNYKL7KVGGNYNYL8EGFNCYFPL9GPKKSTNLV10斯普拉尔斯瓦11LGAENSVAY12FKNHTSPDV13DEDDSEPVL构建了疫苗候选物,并验证了这些表位是否可用于开发针对SARS-CoV-2的鲁棒疫苗。此外,在基于Web的对接服务器上进行分子对接,并进行分子动力学模拟,以比较和验证受体-配体复合物之间的相互作用。此外,根据要求,设计了密码子适应和计算机克隆,用于将来将靶向疫苗扩增到表达载体中。共同地,该计算机验证试图证明具有鉴定的表位的开发的候选疫苗控制SARS-CoV-2感染的有效性。图1.一、 分子对接显示TLR蛋白和构建疫苗候选物之间的非共价相互作用。图二、 TLR诱导的 免疫应答途径示意图。M. Bhattacharya等人医学信息学解锁20(2020)1003943þ图三. TLR蛋白和疫苗候选物复合物的分子动力学(MD)模拟(时间对距离)a)均方根波动(RMSF)图,b)均方根偏差(RMSD)图。2. 材料和方法2.1. 刺突蛋白多表位检索及疫苗设计SARS-CoV-2刺突蛋白的多表位是从我们先前发表的工作中选择和检索的[13]。这些表位被用于构建疫苗,并且这里已经采用类似的方法来分析所提出的疫苗候选物的有效性。2.2. 疫苗组分致新型疫苗应是非过敏性的,因为其令人信服的性能。在此,两个服务器AllerTOP和AllergenFP用于我们的候选疫苗的变应原性评估[14,15]。这两个服务器依赖于自动交叉协方差(ACC)和遗传评估方法的原则。这两种方法利用氨基酸残基的物理化学性质2.3. 分子对接、分子动力学(MD)模拟和简正模分析迁移率分析分子 对接 分析 是 执行 到 研究 稳定蛋白质-蛋白质相互作用和相关的亚细胞功能。对于分子对接,使用了ProteinPro 2.0:蛋白质-蛋白质对接服务器[16]。在RightPro服务器中,刚体对接阶段使用PIPER对接程序,该程序依赖于快速傅立叶变换(FFT)相关方法。PIPER使用形式E的表达式表示两种蛋白质之间的相互作用能;E1E代表2E附件3E附件4EDARS其中:Erep和Eattr表示对范德华相互作用能的吸引和排斥贡献,而Eattr是静电能。EDARS是一种基于成对结构的势函数;它主要代表去溶剂化贡献,即,通过从界面去除水分子而改变自由能。系数w1、w2、w3和w4定义了相应残差的权重为了分析和显示TLR 4/5蛋白和疫苗组分复合物的分子组装体,可视化分子动力学(VMD 1.8.3.)已使用[17]。的均方根计算Cα原子的涨落(RMSF),并选择总蛋白质相对于主链Cα的均方根偏差(RMSD蛋白质复合物的原子。应用本力场,我们完成了10 ps(皮秒)无限制的MD模拟的TLR 4/5蛋白和疫苗候选复合物的酸解折叠状态。最先进的模拟中的幅度可以定义所研究蛋白质的结构和动力学特征[18]。简正模分析迁移率使我们能够研究大分子的大尺度迁移率和稳定性. iMODS服务器基于蛋白质-蛋白质结构复合物进行内部坐标分析[19]。服务器计算大分子的特定组合运动以及二面角共-Cα原子的纵坐标。此外,iMODS估计B因子(一个DIS-B因子),蛋白质中原子的顺序),结构变形性,并计算本征值。2.4. 基于肽的疫苗对照的由于人与大肠杆菌的密码子不同,coli中,使用密码子适应工具。有必要调整原核生物体内的密码子使用以提高在各自宿主系统中的表达速率。为了克隆疫苗组分,E.大肠杆菌K12菌株作为宿主菌。采用Java密码子自适应工具(JCat)对我们的疫苗组分进行密码子优化[20 ]第20段。在此,我们选择了pET28a( 用于克隆的表达载体, 其核 苷 酸 序 列 从 “Addgene” 载 体 数 据 库 收 集 使 用 WebDSVver 2.0(http://www.molbiotools.com/WebDSV/)进行基于肽的疫苗的计算机克隆 组件 对 SARS-CoV-2. 溶解度 及理化候选疫苗一级序列的性质评估对于确定疫苗的状态、稳定性和可及性是必不可少的。根据大肠杆菌的平均溶解度预测构建疫苗的溶解度。在Protein-Sol网络服务器中的大肠杆菌蛋白[22]。访问ProtParam服务器以进一步分析设计的候选疫苗的各种理化性质[23]。3. 结果3.1. 刺突蛋白多表位检索及疫苗设计我 们 收 集 了 13 个 MHC-I ( SQCVNLTTR 、 GVYYHKNNK 、GKQGNFKNL 、 GIYQTSNFR 、 VSPTKLNDL 、 KIADYNYKL 、KVGGNYL、EGFNCYFPL、GPKKSTNLV、SPRRARSVA、LGAENSVAY 、 FKNHTSPDV 和 DEDD-SEPVL ) 和 3 个 MHC-II(IHVSGTNGT、VYYHKNNKS和FKNHTSPDV)9聚体表位。这些表位用于构建基于肽的M. Bhattacharya等人医学信息学解锁20(2020)1003944-见图4。NMA研究的输出a)蛋白质结构域的NMA迁移率b)PDB和NMA的B因子图c)原子波动的变形性图d)本征值图e)协方差矩阵图f)弹性网络图。SARS-CoV-2疫苗(表1)。3.2. 疫苗组分致AllerTOP和AllergenFP服务器均确认了拟定疫苗组分的非过敏性。因此,疫苗接种后可能不会出现任何有害的过敏反应3.3. 分子对接、分子动力学模拟和简正模分析TLR 4/5蛋白与疫苗组分的分子对接结果显示出较高的负能量(1362.3 kcal/mol)。TLR 4/TLR 5的半胱氨酸646与疫苗构建体的酪氨酸189形成非共价键(3.5 π),而TLR 4/TLR 5的苏氨酸647与苯丙氨酸186形成两个非共价键(2.9 π和2.3 π)(图1)。TIRAP受体蛋白中疫苗候选物的可能免疫级联机制已描绘于图1B中。 2[24]。用Visual Molecular Dynamics(VMD 1.8.3.)程序,它产生了700帧(100帧<$5000TS <$410 ps)和RMSD图(图3a和b)。计算Cα原子的RMSF,在RMSD中,针对Cα骨架选择总蛋白。该图显示蛋白质复合物处于稳态。根据正常模式分析迁移率,在结合时,疫苗组分和受体蛋白(TLR 4/TLR 5)显著相互定向(图4a)[25]。变形性图显示出一点波动(图4c),而正常模式分析B因子与PDB B因子相比高度最小化(图4b)。特征值的方差呈反比关系,蛋白质-蛋白质对接复合物,并且估计的特征值为1.129951e-07(图4d)。 在本工作中,协方差矩阵X为通过分别指示氨基酸残基的相关、不相关和反相关对的白色、红色和蓝色变化的图形表示来说明(图4e)。在弹性网络模型中,原子接触的弹簧被绘制为灰色点,其中相互作用的刚度与灰色的梯度成比例(图1)。 4 f)。3.4. 基于肽的疫苗构建体计算机克隆是一种快速评估在给定时间范围内开发有效多表位疫苗的可能性的方法。在此,JCat服务器计算了构建的基于SARS-CoV-2肽的疫苗的优化核苷酸序列的密码子适应指数(CAI)和GC含量。该值分别记录为1.0和46.61654。这些是构建体疫苗在宿主中可能有效表达的预期值。最后,应用WebDSV工具将基于肽的疫苗候选物的适应性密码子序列插入pET 28a(pET)载体内用于表达(图5)。的M. Bhattacharya等人医学信息学解锁20(2020)1003945-¼þ表2图五、 我们在pET 28a(pET)表达载体中对疫苗候选物进行计算机克隆的示意图。考虑到人类致病病毒(西尼罗河病毒和埃博拉病毒)的特异性肽基疫苗已经通过使用我们候选疫苗的不同理化性质。SL.号理化性质分析值1溶解度0.698(可溶性)2数目的氨基酸3993分子量40198.87 Da4理论等电点(pI)8.945原子总数56676式C1740H 2838N 510O 577S 27估计半衰期1 h(哺乳动物网织红细胞,体外)>20 h(酵母,体内)免疫药理信息学技术[28,29]。我们目前研究的主要重点是从确定的共同表位中对有效的候选疫苗进行计算机模拟评价。首先,我们从我们以前发表的工作中选择了16个常见的B细胞和T细胞表位[13]。随后,对所设计的候选疫苗进行致敏性分析。安全有效性是疫苗成功用于人类的先决条件[30]。根据AllerTOP和AllergenFP服务器中的分析,发现构建的候选疫苗是非过敏性的,并且对于未来的体内和体外工作是安全的。 此外,疫苗候选人与TLR蛋白的比较在TMS320Pro 2.0服务器中进行,8不稳定指数9脂肪族指数10亲水性总平均值(重力)>10 h(大肠杆菌,体内)16.64(稳定)-0.552比较并验证准确度、稳定的蛋白质-蛋白质结合和分子相互作用[31,32]。据观察,分子对接是显着的,具有高负能量值(最低能量值1362.3kcal/mol)的顶级有序蛋白质-蛋白质对接复合物[33,34]。基于分子动力学模拟的表2中列出了基于肽的表位疫苗候选物的理化性质和溶解度的细节。我们的候选疫苗显示不稳定指数为16.64(40,稳定),溶解度评分为0.698。估计半衰期确定为1小时(哺乳动物网织红细胞,体外)和>10小时(大肠杆菌,体内)。4. 讨论SARS-CoV-2已成为全球关注的问题,并迅速成为对人类文明的威胁。COVID-19作为一种流行病,已在全球造成多人死亡,并仍在迅速影响人类。因此,通过靶向TLR(TLR 4/TLR 5)调节的新治疗方法可以作为针对SARS-CoV-2感染的疫苗或佐剂开发的更好选择[26]。Kaur等人通过计算机模拟方法开发了一种针对猪带绦虫的基于多表位肽的嵌合疫苗[26]。还针对马亚罗病毒进行了候选疫苗的结构疫苗学分析和计算验证[27]。在对TLR 4/TLR 5和疫苗候选蛋白复合物的改进确定了构象模型处于稳定状态的事实。蛋白质复合物中的残基在700帧(5000 TS 10 ps)内加速了局部能态之间的构象转换,时间对距离轨迹。通过正态模式分析迁移率研究证明了分子对接形成的蛋白质复合物的迁移率[35]。使用iMODS的正态模式分析研究的输出显示,TLR 4/TLR 5和疫苗候选物在分子结合时具有朝向彼此的稳定相互作用运动。此外,复合物不易变形,因为在变形性图中存在显著较低的峰此外,在原核系统内的密码子适应进行了分析,以获得更好的适应和高表达谱在真核表达系统中。当在WebDSVver 2.0的帮助下将构建疫苗候选物克隆到pET 28()表达载体中时,预计克隆的密码子的更高表达。ProtParam工具中预测的pI值表明候选疫苗的基本(富阳离子)特征。预测还有助于计算疫苗在宿主体内的稳定性一个M. Bhattacharya等人医学信息学解锁20(2020)1003946脂肪族指数为61.03预测疫苗是热稳定的,而不稳定指数 低于40(16.60)表明表达后疫苗结构具有较高的稳定性。5. 结论我们的计算机模拟工作表明,所提出的候选疫苗是非过敏性的,并且与人的TLR蛋白具有有效且稳定的分子相互作用。结果还表明所选表位对SARS-CoV-2具有高潜力和有效性。根据条件要求,密码子适应和计算机克隆确定了表达载体内疫苗构建体的即将扩增能力。此外,我们的计算机分析可能会鼓励那些试图开发有效治疗COVID-19的研究人员。然而,构建的候选疫苗需要在体外和体内模型中进行连续的实验室验证。伦理批准和参与不适用因数据和材料本研究期间生成或分析的所有数据均包含在这篇发表的文章中。发表同意书不适用因作者贡献MB和ARS设计了计算框架的模型、计算机模拟分析,并撰写了手稿。PP、PG和GS执行实施和验证。BCP和RPS帮助分析编辑手稿。SSL和CC构思了这项研究,并负责总体方向和规划。竞合利益作者声明,他们没有已知的可能影响本文所报告工作确认这项研究得到了韩国教育部资助的韩国国家研究基金会(NRF)(NRF-2017 R1 A2 B4012944 NRF-2020 R1 C1 C1008694)的支持。&附录A. 补充数据本 文 的 补 充 数 据 可 在 https : //doi 网 站 上 找 到 。org/10.1016/j.imu.2020.100394。引用[1] EE团队。编者按:世界卫生组织宣布新型冠状病毒(2019-nCoV)为第六次国际关注的突发公共卫生事件。Euro Surveill 2020;25(5).[2] 王D,等.中国武汉市2019年新型冠状病毒感染的肺炎138例住院患者的临床特征。Jama 2020;323:1061-9.第11版[3] Huang C, et al.中 国 武 汉2019新 型 冠 状病 毒 感 染 患 者的 临 床 特 征 。 柳 叶 刀2020;395(10223):497-506。[4] CarlosWG,et al. 新型武汉冠状病毒(2019-nCoV) Am J Respir Crit CareMed2020;201(4):7[5] RiouJ,Althaus CL.武汉2019新型冠状病毒(2019-nCoV)早期人传人模式,2019年12月至2020年1月。Euro Surveill2020;25(4).[6] ChanJF-W,et al.与2019年小说相关的肺炎家族聚集性冠状病毒表明人传人:一项家庭聚集性研究。柳叶刀2020;395(10223):514[7] Chakraborty C,et al. 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