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T细胞受体测序数据综合分析工具的开发与应用
软件影响10(2021)100142原始软件出版物用于定义和跟踪人实体器官和造血干细胞移植Aleksandar Obradovica,b,Yufeng Shenb,Megan Sykesa,c,d,Jianing Fua,a哥伦比亚转化免疫学中心,医学系,哥伦比亚大学,纽约,NY 10032,美国哥伦比亚大学系统生物学系,纽约,NY 10032,美国c美国纽约哥伦比亚大学外科系,纽约州10032d美国纽约哥伦比亚大学微生物学免疫学系,NY 10032A R T I C L E I N F O保留字:实体器官移植造血干细胞移植TCR测序同种异体反应克隆免疫耐受A B标准我们已经开发了一套工具,用于T细胞受体测序数据的综合分析, 在人类移植研究中追踪同种异体反应性T细胞。这使得能够发现与临床结果如移植排斥和耐受相关的T细胞富集和缺失的序列和模式。代码库包括用户友好的默认分析和可定制的参数,大大加快了计算工作流程,并提供了将移植后标本与移植前基线进行比较的强大统计数据。它还包括用于T细胞库多样性的稳健表征、样品间差异、合并测定中样品来源模糊性的解决的辅助功能,以及输出定义为同种异体反应性的所有序列的功能。代码元数据当前代码版本v1用于此代码版本的代码/存储库的永久链接https://github.com/SoftwareImpacts/SIMPAC-2021-94可再生胶囊的永久链接https://codeocean.com/capsule/1539294/tree/v2法律代码许可证GPL-3.0使用git的代码版本控制系统软件代码语言,工具和服务使用R编译要求、操作环境和依赖关系代码稳定到当前的R版本3.6.2如果可用,请链接到开发人员文档/手册参见表1问题支持电子邮件azo2104@cumc.columbia.edu1. 介绍该代码包采用R编程语言实现,旨在自动分析实体器官移植(SOT)或造血干细胞移植(HSCT)研究背景下生成的高通量T细胞受体测序(TCR-Seq)数据。特别是,当从移植前血液或淋巴组织进行混合淋巴细胞反应(MLR)时,通过比较这些样本,我们能够比较基线和抗原刺激的T细胞的库,以将宿主抗移植物(HvG)或移植物抗宿主(GvH)同种异体反应性克隆的集合定义为在体内抗原暴露后频率增加(或在耐受性设定中降低)预定频率阈值的克隆。 随后,我们可以跟踪这些克隆在后续活检和血液样品中的身份和富集,评估不同组织或时间点的HvG或GvH免疫应答水平。这使得研究本文中的代码(和数据)已由Code Ocean认证为可复制:(https://codeocean.com/)。更多关于生殖器的信息徽章倡议可在https://www.elsevier.com/physical-sciences-and-engineering/computer-science/journals上查阅。联系人:哥伦比亚转化免疫学中心,哥伦比亚大学,650 West 168th street,Black Building 1511,NY,10032,United States。电子邮件地址:jf2977@cumc.columbia.edu(J.Fu)。https://doi.org/10.1016/j.simpa.2021.100142接收日期:2021年8月5日;接收日期:2021年9月7日;接受日期:2021年9月14日2665-9638/©2021作者。由Elsevier B. V.发布,这是CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表软件影响杂志 首页:www.journals.elsevier.com/software-impactsA. Obradovic,Y.沈,M。Sykes等人软件影响10(2021)1001422图1.一、 概念分析工作流。PreTx:移植前; Unstim:未刺激; Stim:刺激的CFSE受试者群体。器官移植排斥和耐受的动力学、HSCT后移植物抗宿主病(GVHD)的发作以及用于移植物排斥和GVHD的早期预测的新型基于测序的生物标志物的开发。2. 软件方法学作为输入,分析流水线假设TCR克隆计数的数据表被聚合,使得每个独特的TCR克隆被表示在数据矩阵的独特行中,并且每个样本被表示为列(参见图1B)。①的人。至少,CD4基线未刺激的库、CD4抗原刺激的库、CD8基线未刺激的库、CD8抗原刺激的库和至少一份移植后血液或活检标本(在以下文本、图和表中使用活检作为说明性示例)需要列。数据矩阵格式作为Adaptive Biotechnologies的ImmunoSeq平台的标准输出提供应用几个主要原则来定义生物学相关的同种异体反应性TCR克隆,包括(1)所有序列来自FACS分选的CD4和CD8 CFSE细胞群以反映它们的同种异体反应性,活性;(2)当比较CFSE筛选群体中的频率与未刺激群体中的频率时,所有序列均满足≥2-������������������ 较小程度的旁观者增殖;(3)CFSE扩增群体中序列的最小频率截止以避免背景噪声;(4)解决由于分选错误导致的CD 4和CD 8 T细胞之间以及由于生物共享和/或分选不确定性导致的供体和受体序列之间的不确定性。推荐的数据预处理步骤包括将数据矩阵的行名()设置为TCR克隆字符串(核苷酸或氨基酸序列),并为活检与基线的每次比较定义单独的CD4和CD8输入对象,如图所示。1,并在https://github.com/Aleksobrad/TCR-analysis/blob/master/TCRanalysis.zip的代码注释中进行了描述。默认的run()函数解决了分选的CD4和CD8 T细胞之间的模糊性,并使用可调的倍数扩增阈值定义同种异体反应性克隆和最小观察频率,在移植前基线与活检中进行同种异体反应性克隆动力学的多达三个统计学检验(相对扩增分析、转换分析和绝对扩增分析,参见图1B)。表1)。为了实现可定制的工作流程,我们还包括一套辅助函数,以将克隆计数标准化为频率,解决流式分选模糊性,输出同种异体反应性克隆TCR序列的列表,并量化TCR克隆计数的任何任意载体的库多样性。 我们还包括用于通过丰度图可视化库多样性的功能以及任何数量的样品中成对库重叠的量化。 建议在计算多样性之前使用丰度图来可视化每个样品的克隆频率分布,以获得见解多样性的减少是由于少数优势克隆还是我们以前研究中讨论的整体克隆扩张[3]。 表1详细列出了函数及其可自定义参数的完整列表。3. 影响概述我们的平台将功能测定(MLR)与高通量TCR β链互补决定区3(CDR 3)DNA测序相结合,以在人类移植后跨时间和空间定义和跟踪同种异体反应性克隆[1 - 6 ],这是研究SOT后移植物排斥[ 1 - 6 ]和HSCT后GVHD的重要工具,如已发表的研究[ 9,10 ]以及通过与哥伦比 亚 大 学 Ran Reshef 博 士 的 个 人 交 流 ( https : //cdmrp.army.mil/search.aspx网站。提案编号:CA171008)。我们能够鉴定出与患者临床结果相关的生物学相关TCR克隆这种方法使我们能够区分克隆缺失与无反应性,从而更深入地了解移植后的免疫我们的R脚本能够有效地处理大规模数据集,并已成功应用于多种类型的SOT后的各种同种异体反应性研究。基本的代码工作流程很直观,实验室中的非计算研究人员可以快速掌握,同时提供足够的模块化,以便更有经验的用户轻松定制。A. Obradovic,Y.沈,M。Sykes等人软件影响10(2021)1001423表1功能列表和简短说明。功能描述默认情况下,打印总结数据表以输出文件,通过独特克隆总数和每个克隆中可映射的同种异体反应性与非同种异体反应性克隆的数量比较移植前基线与指定活检样本。 默认分析模式比较活检中可映射克隆与基线的同种异体反应性率(通过独特克隆分数和累积频率)。这是通过将Fisher精确检验应用于以下列联表来完成的preTx同种异体反应性总preTx可映射为同种异体反应性或非同种异体反应性的活检– biopsy默认情况下包括但未激活的其他分析包括营业额、绝对扩张和克隆性,见下文。cd4(必填):TCR克隆计数的组合数据框,列(按顺序)代表移植前未刺激的CD4、移植前抗原刺激的CD4和活检cd8(必填):TCR克隆计数的组合数据框,列(按顺序)代表移植前未刺激的CD8、移植前抗原刺激的CD8和活检倍数:从未刺激的组库到抗原刺激的组库所需的最小倍数扩增,以将TCR克隆定义为同种异体反应性。默认设置为5freq:如果在抗原刺激但未刺激的细胞中检测到,则将克隆定义为同种异体反应性所需的最低频率运行(cd4,cd8,fold= 5,freq= 0.00001,克隆性=F,周转率=F,绝对扩张=F,ambiguityRatio= 5,文件名=抗原未刺激的库(在这种情况下倍数扩增=无穷大)。应代表测序实验的倍数 * 最小检测阈值。克隆性:当设置为TRUE时,输出移植前基线和活检中整个库和同种异体反应性克隆子集的克隆性。转换:当设置为TRUE时,对移植前同种异体反应性克隆是否比非同种异体反应性克隆更可能持续到活检时间点进行统计学检验。这是通过将Fisher精确检验应用于以下列联表来完成的在preTx unstim和活检中检测到非Allo克隆在preTx unstim中检测到非Allo克隆,但在活检中未检测到在preTx unstim和活检中检测到的同种克隆在preTx unstim中检测到Allo克隆,但在活检绝对扩增:当设置为TRUE时,进行同种异体反应性克隆是否更有可能在移植前未刺激样本或活检中被检测到的统计学检验。这是通过将Fisher精确检验应用于下列列联表preTx unstim中的Allo克隆从preTx stim定义的Allo克隆总数-preTx unstim中的活检中的Allo克隆根据preTx刺激定义的总Allo克隆-活检中的ambiguityRatio:用于解决CD4与CD8分选错误的克隆频率的比率。CD4和CD8中均存在克隆在一个群体中频率>ambiguityRatio较高的将从另一个群体中移除。频率差小于ambiguityRatio的克隆将从两者中删除文件名:输出表将附加到的文件的名称。normalize(data)将输入数据矩阵的每列从原始TCR克隆计数缩放为归一化克隆频率,求和为1。数据:克隆计数的数据框,其中行是唯一TCR测序,列是样本计算给定样本的TCR库的克隆性(熵除以最大可能熵)。范围为0至1,其中较高的分数表示较大的克隆扩增和较低的库多样性。x:给定样本的克隆计数或归一化频率的向量计算给定样本的TCR库的熵。最低可能得分为0,上限取决于独特克隆的数量。x:给定样本的克隆计数或归一化频率的向量计算给定样本的TCR库的辛普森指数。平方和适用于克隆频率,其中较高的分数表明较低的多样性和优势克隆更重的权重。x:给定样本的克隆计数或归一化频率的向量计算给定样本的TCR库的R20。这表示捕获20%总克隆频率所需的最小克隆分数。R20 0.2表示非均匀克隆频率,数值极低一个群体中的比率较高者将从另一个群体中移除。频率差小于ratio的克隆将从两者中以与main run()函数相同的方式生成同种异体反应克隆,并输出CD4和CD8同种异体反应克隆TCR序列作为列表,索引使得列表项1是所有CD4同种异体反应性克隆序列的集合,并且列表项2是所有CD4同种异体反应性克隆序列的集合。是所有CD8同种异体反应性克隆序列的集合cd4(必填):TCR克隆计数的组合数据框,列(按顺序)代表移植前未刺激的CD4和移植前抗原刺激的cd8(必填):TCR克隆计数的组合数据框,列(按顺序)代表移植前未刺激的CD8和移植前抗原刺激的CD8。倍数:从未刺激的组库到抗原刺激的组库所需的最小倍数扩增,以将TCR克隆定义为同种异体反应性。默认设置为5freq:如果在抗原刺激的而不是抗原未刺激的库中检测到,则将克隆定义为同种异体反应性所需的最小频率(在这种情况下,倍数扩增=无穷大)。应代表测序实验的倍数 * 最小检测阈值。ambiguityRatio:用于解决CD4与CD8分选错误的克隆频率的比率。CD4和CD8中均存在克隆在一个群体中频率>ambiguityRatio较高的将从另一个群体中移除。频率差小于ambiguityRatio的克隆将从两者中删除对于归一化计数矩阵的给定输入,创建可视化库多样性的图形丰度图,每列“数据”的颜色都不同。以每个独特TCR频率表示的TCR克隆数量的对数-对数图,其中斜率越陡表示TCR库的克隆多样性越大数据:标准化克隆频率的数据框,其中行是唯一TCR测序的,列是样品。从起始计数矩阵,使用normalize()进行预处理计算任意两个克隆频率向量的詹森-香农散度(JSD)。这是库相似性的量度,其说明共享克隆的频率(即,高频克隆中的重叠比低频克隆中的重叠更重地加权)。计算为熵(x)+熵(y)之和除以熵向量x+y的总和。从0到1,其中0表示具有相同克隆频率的相同库1表示没有共享克隆。x:给定样本的克隆计数或归一化频率的向量y:给定样本的克隆计数或标准化频率的向量对于代表不同TCR组库样本的数据中的列的每个成对组合,计算jensen_shannon发散分数。输出结果表。对所有克隆分别重复此过程,每个样本中频率最高的前5000个克隆,前1000个克隆的集合,前500个克隆的集合克隆,以及前100个克隆的集合数据:克隆计数或频率的数据框,其中行是唯一TCR测序,列是样本两个样品将远远超过我们另外推荐的2-5倍的截止比率,并且具有合理高的模板计数的克隆将被定义为不明确的并被0覆盖。在这种情况下,我们建议通过人工检查数据来解决克隆模糊性。默认的run()函数是用户友好的,并且能够以自动化的方式非常快速和强大地比较跨患者和跨组织部位的多个样本,将我们以前的工作流程时间从手动操作Excel电子表格的几天减少到在给定实验中执行每个样本的代码的几分钟。考虑到商业上可获得的测序平台的发展,例如已经经历了几代发展的Adaptive Biotechnologies,数据输出从读取计数变为模板计数。因此,我们根据反映技术差异的功率分析调整了最小频率截止值,利用了调整run()和listAlloreactive()函数参数的能力,而无需重写代码。例如,当使用读段计数时,定义来自CFSE扩增样本的同种异体反应性克隆序 列 的 最 小 频 率 阈 值 设 定 为 0.001% , 当 使 用 模 板 计 数 时 设 定 为0.002%,这用于确保85%的可重复性,如通过功效分析确定的4. 应用综述我们的方法和R脚本[11]已经被我们广泛使用[1 6]和其他人[7,8]在多种类型的人类SOT研究中,包括肠[2,5,6],肝[4],心脏[7],肾[8]和肾脏和骨髓联合移植[1]。我们的平台允许在单细胞水平上整合T细胞克隆型、同种异体反应性和RNA谱,以将T细胞功能谱与单个T细胞的克隆型相关联[6]。此外,通过将移植前和移植后MLR与单细胞RNA+TCR测序相结合,我们现在能够在TCR克隆的单独RNA-Seq表型上运行该管道,定义HvG克隆的多个功能类别,包括持久性、耐受性、从头产生、获得性和缺失的HvG克隆,以解决局部和全身免疫耐受性的问题[12,13]。我们独特的平台和R脚本还有助于开发治疗策略,以诱导肠移植后长期持续的混合嵌合体并诱导耐受。 基于我们最近在人肠移植后的研究[5,6],哥伦比亚大学欧文医学中心即将启动一项试验性临床试验,在循环中淋巴造血GvH反应达到峰值时将多脏器移植与供体CD34 +细胞输注相结合,以促进长期多谱系嵌合体。此外,我们的方法可以帮助开发替代监测策略,以最大限度地减少或完全避免人类肾移植后的侵入性和延迟诊断程序[8]。参考文献[1A. Obradovic,Y.沈,M。Sykes等人软件影响10(2021)1001425CRediT作者贡献声明Aleksandar Obradovic:方法论,软件,数据管理,可视化,写作沈玉峰:概念化,方法论,软件,监督,写作评论编辑. 梅根·赛克斯:概念化,方法论,监督,写作傅佳宁:概念化,调查,方法论,软件,监督,撰写-竞合利益作者声明,他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系,可能会影响本文报告的工作致谢这项工作得到了美国国立卫生研究院(NIH)、国家过敏和传染病研究所(NIAID)的部分支持,美国基金#P01AI106697(授予M.赛克斯和Y. Shen),#UM1 AI109565(至M.Sykes)和#R21 TR002279(至M.赛克斯)和美国移植研究网络指导研究基金会#gAST182D0MS(给M。Sykes)。J.Fu获得了由美国国防部(DoD)资助的国会指导医学研究计划(CDMRP),美国发现奖W81 XWH-20-1-0159,以及由哥伦比亚大学欧文医学中心的纳尔逊家庭移植创新奖计划资助的纳尔逊教师发展奖,美国UR 011630 -01的支持。引用[1]H. Morris,S. DeWolf,H.罗宾斯湾Sprangers,S.A. LoCascio,文学士Shonts等人 , Tracking donor-reactive T cells : Evidence for clonal deletion in tolerantkidneytransplantpatients.Transl.7 (272)(2015 )272,http://dx.doi.org/10.1126/scitranslmed.3010760 , 272ra10 。 PubMed PMID :25632034; PubMed Central PMCID:PMCPMC 4360892。[2] J.Zuber,B. Shonts,S.P. Lau,A. Obradovic,J. Fu,S. Yang等人,双向移植物内同种异体反应性驱动人肠同种异体移植物的再增殖并与临床结果相关,Sci. Immunol. 1(4)(2016)eaah3732。[3]S.德沃尔夫湾Grinshpun,T. Savage,S.P. Lau,A.奥布拉多维奇湾Shonts等人,量化人类T细胞同种异体反应的大小和多样性,JCI Insight3(15)(2018)http://dx.doi.org/10.1172/jci.insight.121256 , Epub2018/08/10.PubMedPMID:30089728; PubMed Central PMCID:PMCPMC 6129121。[4]T.M. 萨维奇文学士 Shonts,S.刘,A.奥布拉多维奇,H.罗宾,A.颤抖, 例如,人肝移植后供者反应性t细胞克隆的缺失J.移植。关闭. J. Am. Soc. Transplant. Am. Soc. Transpl. 外科医生20(2)(2020)538http://dx.doi.org/10.1111/ajt.15592PubMed PMID:31509321;PubMed Central PMCID:PMCPMC 6984984。[5] J. Fu,J. Zuber,M.马丁内斯湾,巴西-地Shonts,A. Obradovic,H. Wang等人,人肠同种异体移植物含有由循环池维持的功能性造血干细胞和祖细胞,CellStemCell24(2)(2019)227http://dx.doi.org/10.1016/j.stem.2018.11.007[6] J. Fu,J. Zuber,B. Shonts,A.奥布拉多维奇山Wang,K. Frangaj等人,淋巴造血移植物抗宿主反应促进接受肠移植患者的混合嵌合体,J。 Clin. Invest. 131(8)(2021)http://dx.doi。org/10.1172/jci141698,Epub 2021/02/26.PubMed PMID:33630757。[7]M.V. Habal,A.M.I.米勒,S。拉奥,S。Lin,L. Obradovic,M. Khosravi-Maharlooei等人,T细胞库分析表明,一个突出的旁观者反应在人类心脏移植血管病变,美国。J.移植。关闭. J.Am. Soc. Transplant. Am. Soc. Transpl.外科医生21(4)(2021)1465-1476,http://dx。doi.org/10.1111/ajt.16333,PubMedPMID:33021057。[8]C. Aschauer,K. Jelencsics,K. Hu,黄毛菊A. 作者:J. Fraunhofer等人, 肾移植患者排斥反应期间同种异体反应性T细胞受体库的下一代测序评估:一项前瞻性队列研究,BMCNephrol。20(1)(2019)346,http://dx.doi.org/10.1186/s12882-019-1541-5 , Epub 2019/09/04 。 PubMedPMID:31477052; PubMed Central PMCID:PMCPMC 6719356。[9] O. Shah,J.S.塔马雷西,L. J.凯尼恩,L. Xu,P. Zheng,P. Gupta,et al.,分析在2个临床队列中,Biol.Blood Marrow Transplant. J.Am. Soc. 骨髓移植。 26(6)(2020)1050 http://dx.doi.org/10。1016/j.bbmt.2020.01.020,Epub2020/02/23 。 PubMedPMID : 32081787;PubMedCentralPMCID :PMCPMC7503214。[10] F. Bettens,Z. Calderin Sollet,S. Buhler,J.Villard,人白细胞抗原I类不匹配的同种 异 体 反 应 性 免 疫 应 答 中 的 CD8+ T 细 胞 库 , Front. Immunol.11 ( 3440 )(2021)http://dx.doi.org/10.3389/fimmu.2020.588741。[11] A. Obradovic,Y.沈,M。Sykes,J. Fu,用于定义和跟踪人类实体器官和造血干细胞移植后同种异体反应性T细胞克隆的综合分析工具集[源代码],2021,http://dx.doi.org/10.24433/CO。8853858.v2.[12] J. Fu,Z. Wang,M. Martinez,K. 弗兰加伊河琼斯先生,十五郭、et 例如,人类肠道同种异体移植物的单细胞免疫分析揭示了与移植物结局相关的驻留 记 忆 T 细 胞 的 异 质 性 和 同 种 异 体 反 应 性 , 移 植 104 ( S3 ) ( 2020 )http://dx.doi.org/10.1097/01.tp.0000698616 。 71945.ca , S72-S3 。 PubMedPMID:00007890-202009003-00093。[13] J.Fu,Z. Wang,M. Martinez,K.弗兰加伊河琼斯,X。 Guo等人,O-40:人肠同种异体移植物的单细胞免疫分析揭示了HvG T细胞克隆在静止与慢性排斥性同种异体移植物中的差异贡献,移植105(7S)(2021)。[14] W. Jiao,M. Martinez,J. Zuber,A.奥布拉多维奇河琼斯,E。Waffarn等人,PE-2 :人肠移植后受体驻留记忆T细胞库的动态重建,移植105(7S)(2021)。
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