"正常兔膝关节软骨细胞体外培养体系的建立和鉴定"
这篇论文的主要目的是建立一个有效的兔膝关节软骨细胞体外培养体系,并对其进行鉴定,以便为后续的生物学研究提供细胞来源。该研究由朱芸和裴福兴等人进行,他们使用的是新西兰大白兔作为实验对象。
实验方法包括以下几个关键步骤:
1. 在无菌环境下进行手术,从兔的双膝关节中取下股骨髁和胫骨平台的全层软骨。
2. 使用胰酶和II型胶原酶的顺序消化法来分离软骨细胞。这种方法利用了这两种酶对软骨组织的不同分解能力,可以有效地获取纯净的软骨细胞。
3. 将获取的软骨细胞置于含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM低糖培养液中进行培养和传代。FBS富含细胞生长所需的营养成分,而DMEM低糖培养基则为细胞提供了适合的生长环境。
4. 对传一代的软骨细胞进行染色鉴定,包括使用甲苯胺蓝、番红O和II型胶原染色。这些染色方法能帮助识别和确认细胞类型,特别是软骨细胞特有的II型胶原。
5. 通过MTT法(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)检测细胞的增殖活性,这是评估细胞生长状态和活力的常用技术。
实验结果显示:
- 原代细胞在培养12小时后开始贴壁,24小时后全部贴壁,48小时后数量显著增加,呈现出多角形不规则形状。
- 细胞在3-4天内快速增殖,形成大量细胞集落,约5天左右开始融合,覆盖培养瓶底部。
- 6-7天时,细胞融合度达到80%,此时进行传代。
- 传二代后,细胞开始出现肥大,生长速度减缓。
- 甲苯胺蓝、番红O和II型胶原染色结果均为阳性,表明细胞保持了软骨特性。
- MTT结果显示,细胞在第4天进入对数生长期,第8天进入平台期,揭示了细胞生长的典型周期。
结论是,该实验成功地建立了兔膝关节软骨细胞的体外培养系统,并能进行有效传代。细胞在第4天进入活跃增殖阶段,但传二代后可能开始失去部分分化特性。这个培养体系为软骨生物学的研究提供了宝贵的工具,尤其是在关节外科和软骨修复领域的应用。