没有合适的资源?快使用搜索试试~ 我知道了~
单分子纳米孔测序直接检测RNA修饰和结构
技术使用单分子纳米孔测序直接检测RNA修饰和图形摘要亮点d纳米孔测序在单分子水平D 20-O-甲基(Nm)和假尿嘧啶(J)改变纳米孔迁移动力学D AcIm是一种产生小加合物的SHAPE-MaP试剂dAcIm能够对RNA作者William Stephenson,RohamRazaghi,Steven Busan,KevinM.Weeks,Winston Timp,PeterSmibert对应stephenson. gene.com简言之Stephenson等人采用直接RNA纳米孔测序来检测单个RNA分子上的作者证明了检测内源性2-O-甲基化(Nm)天然核糖体RNA,证实了已知的修饰模式。他们描述了nanoSHAPE的发展,这是一种涉及用小加合物生成化学探针外源标记RNA的方法,该探针可以使用长读序来揭示RNA结构Stephenson等人,2022,细胞基因组学2,1000972022年2月9日-作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100097会会开放获取技术使用单分子纳米孔测序直接检测RNA修饰和结构威廉·斯蒂芬森,1,4,6,*罗翰·拉扎吉,2史蒂文·釜山,3凯文·M。Winston Timp,2and Peter Smibert1,51技术创新实验室,纽约基因组中心,纽约,美国2生物医学工程系,约翰霍普金斯大学,巴尔的摩,MD,美国3化学系,北卡罗来纳大学,教堂山,NC,美国4现住址:Genentech,South San Francisco,CA,USA5现住址:10x Genomics,Pleasanton,CA,USA6主要联系人* 通讯地址:stephenson.gene.comhttps://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100097总结修饰存在于许多种类的RNA上,包括tRNA、rRNA和mRNA。这些修饰调节不同的生物过程,如遗传编码和mRNA的输出和折叠。此外,可以使用揭示RNA结构和动力学的化学探测策略将修饰引入RNA分子存在许多通过短读段测序检测RNA修饰的方法;然而,基于短读段的方法固有的读段长度的限制使修饰与其天然背景分离,从而阻止单分子修饰分析。在这里,我们展示了直接RNA纳米孔测序,以检测内源性和外源性RNA修饰长RNA在单分子水平。 我们检测到内源性的20-O-甲基和碱基修饰的离子。 coli和革兰氏阳性菌S. 通过与解旋酶马达蛋白的相互作用,作为电流信号和远端停留时间的变化的cerevisiae核糖体RNA我们进一步使用20-羟基反应SHAPE试剂乙酰咪唑在单分子水平上探测RNA结构,并通过直接纳米孔测序进行读出。介绍已经鉴定了100多种不同的RNA修饰这些修饰对RNA结构和功能表现出不同的影响,包括稳定性、翻译效率、结构动力学、核输出和翻译重编码1-3的调节,并且在某些情况下,被修饰“写入器”、"读取器“和”擦除器“安装、读取或移除,表明转录后基因调控的动态模型。4,520-O-甲基(Nm)修饰发生在真核生物mRNA(m 7 GpppNmNm)的5 0帽中,并广泛存在于核糖体RNA(rRNA)中。Nm修饰也已在mRNA6的编码区内检测到,并且似乎在翻译期间调节同源tRNA选择,从而调节蛋白质合成动力学。7假尿苷(J),通常被称为第五个碱基,因为它广泛存在于不同种类的RNA中,通过尿嘧啶的异构化产生具有独特氢键和碱基配对特性的核苷,并且相对于尿苷增加了碱基堆积倾向。8,9RNA修饰的缺失或减少已经暗示了多种疾病,包括癌症、心脏病和遗传疾病。10-目前检测转录后RNA修饰的方法分为三大类。免疫沉淀方法使用对单个修饰具有特异性的抗体来富集具有修饰的RNA的短片段,然后将其转化为cDNA并用短读段测序。13,14这些方法可以应用于全基因组,但并不总是提供核苷酸解析,并且受到下拉试剂的可用性和特异性的限制。另一种方法利用逆转录酶(RT)的倾向,即当遇到修饰的RNA碱基时终止cDNA合成或掺入非互补核苷酸。6,15-这些方法中的每一种都已被证明在特定环境中是有用的,但所有这些方法都具有有限的分辨率,并且通常一次只能探测一个修改。RNA的外源性修饰已被用作时间标签来测定RNA动力学,包括稳定性、周转和剪接时间。20化学探针修饰核碱基(例如硫酸二甲酯[DMS])或核糖20-羟基,通过引物延伸(SHAPE)分析选择性20-羟基酰化Cell Genomics2,100097,February 9,2022<$2022作者。1这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。会开放获取技术2Cell Genomics2,100097,2022战略布局通过利用修饰残基处的RT终止或通过在RT通读期间检测修饰位点对面的突变来检测SHAPE试剂诱导的修饰的位置后一种方法,称为通过引物延伸和突变谱分析(SHAPE-MaP)分析的选择性20-羟基酰化,24产生单核苷酸分辨反应性模式,并且可以在转录组范围内使用。25,26然而,SHAPE-MaP技术受到当前短读测序的限制。用于研究内源性和外源性RNA修饰的理想方法将检测多种类型的修饰,并且将允许观察同一RNA分子上的多种修饰。直接RNA纳米孔测序已经成为用于全长测序和分析细胞衍生的和 合 成 的 RNA 分 子 的 在 由 Oxford Nanopore Technologies(ONT)开发的商业平台中,RNA经由马达蛋白易位通过悬浮在膜中的生物纳米孔(图1A)。当RNA在电压偏压下通过孔时,观察到的π安培离子电流的变化是位于孔收缩处的5个核苷酸(“kmer”)的化学身份和序列的特征二十七、二十八在这里,我们采用ONT平台上的直接RNA测序来检测内源性和外源性RNA修饰。重要的是,我们表明,来自纳米孔测序的原始电流信号检测RNA修饰,而不依赖于修饰的化学性质。此外,我们描述了在时域中的修饰依赖性信号,涉及到通过纳米孔的单分子的易位率该时域信号提供了信息的互补维度,其可以与电流信号结合用于核苷酸修饰类别的从头基于这些见解,我们开发了nanoSHAPE,它将长读段直接RNA测序与一种新的SHAPE试剂相结合,凭借其高反应性和小加合物尺寸,可以对长RNA中的结构进行全长探测。结果鉴定16S rRNA我们首先将直接ONT RNA测序应用于来自大肠杆菌和酿酒酵母的rRNA;这些rRNA是高度丰富的并且具有良好表征的修饰(数据S1)。我们生成了作为对照的小亚基和大亚基RNA的体外转录物,其没有修饰(图S1A和S1B)。对这些体外转录(IVT)对照进行独立测序,以提供无修饰的基线,可与天然细胞衍生RNA进行比较,以鉴定推定的修饰位点。29、30个IVT对照和天然RNA显示预期长度的读数,E. coli(16S:1.5kb,23S:2.9kb)(图1B)和S. 8kb,25S:3.4kb)(图S1C)。值得注意的是,来自E.大肠杆菌的感染率低于天然样品与IVT对照相比的感染率(16S:-0.53,23 S:-0.31,t检验p 0.05);结果相似,S. 酿酒酵母(图S1D)。这种减少可能反映了更高的修饰水平对使用修饰未知碱基识别软件的当前迭代的读取质量有影响。对于所有样品,包括IVT对照(图S2),覆盖率朝向5 °末端较低,如从直接RNA纳米孔测序的配置所预期的,其在3°至5°方向上易位RNA。使用Tombo31和Nanopolish32处理读数,其执行原始电流-信号-电平-序列比对。作为一个例子,我们强调了一个区域的电流信号映射与Tombo的16S rRNA在E。在大肠杆菌中含有两个邻近的修饰:N4,20-O-二甲基胞嘧啶(m4Cm)在1402位和5-甲基胞嘧啶(m5 C)在1407位(图1C)。我们在位置1402处观察到天然样品的电流信号分布的明显偏差,而由于在位置1407处的化学上不同的m5 C修饰引起的电流信号偏差不太明显,并且分布在三个位置1406-全面的rRNA修饰检测接下来,我们检查了纳米孔测序是否可以检测E. coli33和S. 酿酒酵母(数据S1)。34在小亚基和大亚基rRNA中观察到天然和IVT样品之间的归一化电流和停留时间差异,与已知修饰的位置一致(图S3)。为了更严格地评估高度依赖于kmer序列背景的修饰信号,我们使用Tombo和Nanopolish(STAR方法;图 1D和S4)对来自原始信号比对数据的电流和停留时间的所有位置进行了非参数Kolmogorov-Smirnov检验(KS)KS统计特征中的峰表明IVT未修饰对照样品和天然样品之间的分布差异。电流信号的KS统计量在Tombo和Nanopolish之间具有强相关性(Pearson相关性,r = 0.75一般来说,电流的KS统计峰值在已知修饰的±2 nt。为了评估修饰类型的特征,我们整理了来自两个大肠杆菌的所有RNA修饰,这些RNA修饰跨越了核糖体的小亚基和大亚基。coli和革兰氏阳性菌S. 酿酒酵母,将它们通过它们已知的修饰位置进行比对,并考虑跨修饰类别的聚集中值KS统计概况:Nm、J和碱基(例如,碱基修饰,不包括J)。所有修饰类别的电流的中值KS统计在修饰位点(孔收缩)处具有可感知的信号,如预期的(图1E,顶行)。关于停留时间,中值KS统计曲线对于Nm和假尿苷修饰而不是碱基修饰表现出两个峰(图1E,底行)。主峰出现在纳米孔收缩处(相对修饰位置0);然而,在30方向上观察到约10 nt的次峰,Nm修饰表现出比J更大的中值KS统计。该10-nt距离是从孔收缩到位于纳米孔顶部的运动蛋白的DNA纳米孔测序实验中的Xr使用更末端定位的孔Cell Genomics2,100097,2022年2月9日3会开放获取技术图1. 直接RNA纳米孔测序和修饰检测(A) 用于直接RNA纳米孔测序的方案。含有天然修饰的rRNA在连接接头和RT之前加聚(A)尾。离子电流阻断事件是RNA的kmer序列通过孔收缩的特征。(B) 读取来自E. 杆菌红色虚线表示16S rRNA(1.5 kb)和23S rRNA(2.9 kb)的预期长度(C) 来自大肠杆菌的16S rRNA的标准化天然(红色)和IVT(黑色)电流信号比对。coli跨越位置1395-1415进行。此窗口中已知修改的位点以蓝色突出显示。(D) 位置Kolmogorov-Smirnov(KS)统计检验来自E. coli和S.使用Tombo和Nanopolish的酿酒酵母。文献中描述的修饰位置用黑线表示。(E) 按修饰类型(碱基[不包括J],蓝色; 20-O-甲基,红色;和J,绿色)分离的中位电流和驻留KS统计曲线,并通过以下方式对齐来自Tombo和Nanopolish的修饰位置着色的阴影区域表示KS统计量的标准差在MspA和不同的马达蛋白中的收缩表明约20 nt的Xr。在这里使用的R9.4.1版本纳米孔系统中,使用CsgG孔,其具有位于中心的孔收缩,这可能解释了较小的Xr。27有趣的是,这些观察结果表明,至少在某些序列背景下,马达蛋白动力学对N_(mT)h_(mT)和J_(mT)d_(mT) i_(mT)20-O-甲基乙烯基醚的堆积自由能约为-0.2kcal/mol,链RNA,并有利于RNA的C30-内构象。因此,RNA构象的变化或与马达蛋白的特定氨基酸残基的空间和化学相互作用可能会扰乱易位时间。有趣的是,所有类型的修饰在相对修饰位置0处显示出高于背景的停留时间的中值KS统计峰,表明通过纳米孔收缩本身的通过时间也被本文研究的许多修饰扰乱然而,我们4Cell Genomics2,100097,2022会开放获取技术图2.停留时间对修改和顺序的依赖性(A) 天然(红色)和IVT(黑色)样品在16 S和23 S中选定Nm修饰位点的停留时间比较(Mann-Whitney U检验,n = 1,000读数),E. coli中的18S和25S。 啤酒。每个框跨越四分位数范围,每个框内的水平线定义中位数,须线延伸到最小值和最大kmer与修饰位置(红色)一起显示在x轴下方停留时间是从中心修饰位点kmer开始的+Xr(B) 来自前1%停留时间的序列基序(仅IVT样品,16 S、23 S、18 S和25 S),跨越涵盖整个生物分子测序复合物的30-nt窗口(C) IVT样本中三聚体(位置-9、-10和-11)内的核苷酸表示(分数),作为停留时间百分位数的函数最高的停留在三聚体中富集鸟苷的时间序列。未观察到缺失或插入错误频率的显著变化,而这可能是从这些停留时间差异中预期的(图S5)。 由于J或Nm修饰而观察到的大多数错误是以修饰位点为中心的错配,其中J具有48%错配的最高平均错误。RNA易位率对核苷酸修饰和序列组成敏感我们接下来研究了作为位置的函数的停留时间,以确定是否修改和/或序列内容物每涡轮停留时间。在距离E内选定部位30 °方向上 Xr 处 , 比 较 天 然 和 IVT 样 品 的 停 留 时 间 。coli16S(1402m4Cm)、大肠杆菌E. coli 23S(2552 Um),S. cerevisiae 18S(1428 Gm)和S.酿酒酵母25 S(2220 Am)rRNA的表达揭示了天然样品相对于IVT对照的显著增加(Mann-Whitney U检验)(图2A)。为了评估由于序列而不是修饰的存在导致的马达蛋白暂停的程度,我们探索了来自所有IVT样品的排名停留时间的前1%的序列相似性,所述IVT样品在从马达蛋白的上游到纳米孔的出口跨越整个测序复合物的区域中。我们观察到在孔收缩上游约9-11 nt处有很强的鸟苷富集运动蛋白的活性位点对于所有IVT样品,我们在停留时间范围内定量了马达蛋白活性位点中每个核苷酸的代表,所述马达蛋白活性位点定义为纳米孔收缩的位置9-总的来说,这些数据表明,即使没有修饰,直接RNA纳米孔测序实验中使用的马达蛋白这些观察结果与通过用DNA的单分子picometer分辨率纳米孔镊子(SPRNT)实验(使用基于Hel308的易位机制)在富含鸟苷的序列上暂停一致。在富含鸟苷的区域停顿可能是基于酶的易位的一般特征;这些区域可能在空间上阻碍酶,或者高于平均水平的单链堆积能量可能会减慢易位。381-乙酰基咪唑试剂生成致密的SHAPE加合物由于纳米孔测序能够检测RNA中的内源性Nm修饰,我们认为可以检测由折叠RNA暴露于亲电子SHAPE试剂而产生的两种0-0-加合物,这将使我们能够使用纳米孔测序来询问长期的优势,Cell Genomics2,100097,2022年2月9日5会开放获取技术利用纳米孔测序进行结构探测是检测每个分子的多种修饰的可能性,使得能够分析长序列距离上的定相和相关结构39,40我们最初尝试使用已经用建立的SHAPE试剂2-甲基烟酸咪唑(NAI)、1-甲基-7-硝基靛红酸酐(1 M7)和N-甲基靛红酸酐(匪IA)修饰的RNA进行纳米孔测序.在我们手中,在测试的浓度下,与未修饰的对照样品相比,用纳米孔测序的这些实验的读数导致很少的全长读数和差的比对准确度(图S6)。当使用纳米孔测序分析用高浓度NAI(100 mM)修饰的短RNA时,最近报道了类似的较差比对准确性我们观察到,在高浓度(200 mM)和低浓度(25 mM)NAI下,全长读数的比对百分比-年龄和分数都很差,排除了对单个长RNA分子的多重修饰的检测我们假设观察到的低效和不完全的易位是由于存在多个大体积的20-O-芳基加合物,这是RNA与这些SHAPE试剂反应的结果因此,我们寻找一种试剂,其将产生更小的加合物,在化学上更类似于天然Nm修饰。我们研究了五种用于制备20-O-乙酰基的羰 基 咪 唑 化 合 物 。 如预 期 的 , 我 们 发 现 NAI 和 1- 乙 酰 咪 唑(AcIm)(图7)的加合物形成是有价值的。AcIm被预先定义为20-羟基反应性试剂。所提出的AcIm与RNA的 20-羟基甲氧基的反应(图3A)是使用亲电子羰基试剂的最紧密可能的乙酰基加合物。SHAPE试剂与RNA的20-羟基的相对反应速率我们通过监测反应缓冲液中AcIm吸光度的变化来研究AcIm反应性的时间尺度;监测咪唑作为对照。中心在250 nm处的AcIm信号通过单指数衰减,半衰期为37℃下3 min(图3B),与之前N-乙酰基咪唑水解的测量结果一致。42,44AcIm光谱衰减到观察到的咪唑,支持AcIm水解成咪唑和非吸收性乙酸盐。为了评估AcIm与RNA的反应性,我们从E.大肠杆菌中,并用100 mM NAI、13 mM匪IA、100 mM AcIm或DMSO处理的总RNA(作为载体对照)。然后,我们使用突变谱(SHAPE-MaP)24获得每个核苷酸的反应性谱,并将所得cDNA与16 S和23 S rRNA比对(图3C和S8)。三种试剂的反应性曲线高度相关,表明AcIm是一种稳健的SHAPE试剂。AcIm与四种典型RNA核苷酸中的每一种反应,并优先与构象柔性(未配对)核苷酸反应(图3D和S9)。受试者操作特征曲线分析表明,NAI、匪IA和AcIm的配对和未配对核苷酸之间的区分几乎没有差异(所有探针的曲线下面积约为0.8)(图3E和S10)。总之,AcIm产生小的加合物,与所有四种核糖核苷酸广泛反应,并产生与已知试剂一致的SHAPE-MaP反应性谱。nanoSHAPE:AcIm修饰的直接RNA纳米孔测序我们接下来评估了AcIm化学探测是否可以用于基于单分子直接RNA纳米孔测序来指导RNA二级结构建模,我们称之为nanoSHAPE的方法。我们重点研究了体外转录的miR-17~ 92簇的pri-miRNA(primarytranscript),它跨越951个核苷酸,折叠形成一系列明确的发夹结构。45,46预测pri-miR-17~ 92形成中等结构的复合物(预测的DG质心 =我们首先使用AcIm和NAI通过SHAPE-MaP评估pri-miR- 17~92的结构(图S11A)。两种试剂的反应性高度相关(Spear-man rho = 0.78)。此外,由AcImSHAPE-MaP反应性谱通知的二级结构建模产生了与当前pri-miR转录物结构模型一致的质心结构(图S11B)。45这些实验表明,两种化学探针都适用于研究这种结构,并提供了与nanoSHAPE进行比较的对照。我们接下来通过使用未修饰的pri-miR-17~ 92或用5、20、50、75、100、150或200 mM终浓度的AcIm修饰的RNA在AcIm修饰之前,通过氧化和β-消除来修饰末端RNA核苷,以去除30-核苷酸和30-磷酸。在A修饰后,通过磷酸酶处理使β-O-羟基被去除,留下β-O-羟基,允许与RNA测序衔接子连接(图4A).在更高的AcIm修饰率下,我们观察到读取质量和获得的全长读取的分数显著降低这种信号降解降低了Tombo成功比对的读数百分比(图S12A和覆盖率在30和所有连接处更高,这与RNA通过纳米孔的30-50-50个添加方向相同(图S12B)。在最高AcIm浓度(200 mM)下,覆盖度、全长读段的分数和比对的读段在用AcIm修饰后观察到的全长读段的较低分数表明读段在AcIm修饰位点处截短。我们将来自未修饰的RNA和用25 mM NAI或150 mM AcIm修饰的RNA的直接RNA纳米孔测序读段末端映射到pri-miR-17~ 92 RNA到亲本序列,并与SHAPE-MaP反应性曲线进行比较(图S13)。对照和AcIm修饰的数据具有相似的读段末端谱(Spearman's rho = 0.76),其又与SHAPE-MaP反应性谱相似,尽管在3 °方向上移动了大约10-15 nt,这暗示了这些观察结果表明,首先,在没有SHAPE试剂修饰的情况下,固有RNA结构引起小程度的截短,其次,用AcIm修饰略微加重了这些相同区域中的NAI修饰的RNA中的读段末端6Cell Genomics2,100097,2022会开放获取技术图3.乙酰咪唑生成小的加合物,可通过SHAPE-MaP(A) 用乙酰咪唑(AcIm)酰化RNA的示意图。(B) 通过UV吸光度的变化分析AcIm水解的时间依赖性实验在37 ℃下进行(C) 使用匪IA、NAI和AcIm对E. coli16S和23SrRNA。(D) 二维核密度估计的NMIA,NAI,和AcIm加合物诱导的突变率为E。 coli 16S和23S rRNA,x和y轴分别为未修饰的对照和SHAPE修饰的速率。配对(蓝色)与未配对(红色)位置的峰密度分布之间的分离指示关于核苷酸柔性程度的反应选择性。(E) 作为SHAPE试剂合并核苷酸碱基配对状态的函数的MaP反应性的受试者操作特征曲线和相关曲线下面积(AUC)真阳性率:反应性高于给定阈值的未配对核苷酸/总未配对核苷酸。假阳性率:反应性高于给定阈值的碱基配对核苷酸/总碱基配对核苷酸。Cell Genomics2,100097,2022年2月9日7会开放获取技术图4.使用AcIm和纳米孔测序直接探测pri-miR-17~ 92转录RNA的结构(A) 用于30末端修饰、SHAPE探测和30末端拖尾的方案。(B) 通过pri-miR-17~ 92 RNA的电流(红色)和停留时间(灰色)的变化检测的标准化SHAPE-MaP反应性(蓝色)和nanoSHAPE反应性(C) 用150 mM AcIm修饰的pri-miR-17~92的1,000个纳米孔读数的热图。使用Fisher方法,在±1电流信号的背景下,通过每核苷酸学生t检验确定修饰使用Benjamini-Hochberg程序校正每核苷酸p值并二进制化。评分为修饰和未修饰的核苷酸分别以黑色和青色显示;未映射的区域为灰色。(D) 作为AcIm浓度的函数的每个pri-miR-17~92分子的调用修饰数的核密度估计。调用的修改对应于上限。(E) nanoSHAPE和SHAPE-MaP之间的Spearman(F) Spearman从NAI修饰的测序实验获得的全长读段的非常小的部分因此,NAI是一种较差的nanoSHAPE探针,因为这些加合物对马达蛋白的加工和持续合成能力造成严重问题。我们接下来对所有AcIm浓度下的电流和停留时间分布进行KS统计检验,与未改性对照相比(图S14A)。电流中的KS峰值在所有图谱中观察到,主要在pri-miR-17~ 92的单链我们确定了电流KS和停留时间KS(偏移Xr)与AcIm SHAPE-MaP曲线的Spearman电流的抑制作用最大,在150 mM时最大(电流rho =0.51,停留时间rho = 0.28)。为了评估基于单分子的反应性曲线重建的能力,我们8Cell Genomics2,100097,2022会开放获取技术在所有AcIm浓度下,对pri-miR-17~92的1,000个单独全长分子内的每个核苷酸位置进行每次读取统计测试和归一化(图4B、4C和S15)。来源于用25 mM和200 nM AcIm修饰的pri-miR-17~92的SHAPE-MaP文库的中值突变率分别为0.03%和0.1%,其对应于每个全长读数分别检测到0.285和0.951个加合物。这些低值表明当前的MaP方法不能有效地检测AcIm加合物。基于单分子纳米孔数据,并且在统计学测试和检测之后,我们在150mM AcIm下获得了每个全长读段大约105个所谓的修饰位点(图4D)。由于修饰检测的分布性质和由于当前生成的纳米孔固有的高水平噪声,该值可能被显著夸大尽管如此,这些比较表明,纳米孔检测在检测复合物20-核糖核酸方面更有效,并且在检测复合物20-核糖核酸方面更有效。我们接下来检查了获得与SHAPE-MaP的最佳相关性所需的单分子读数的数量。我们对n = 1至n = 1,000的全长读段进行二次采样,并根据读段数量计算来自每次读段电流统计检验的归一化反应性曲线。对于每个AcIm浓度,归一化反应性相对于SHAPE-MaP反应性谱的斯皮尔曼在来自nanoSHAPE的标准化反应性谱中,我们观察到更接近pri-miR-17~ 92转录物的50为了探索这一现象,我们计算斯皮尔曼该程序揭示了在距转录物的5°末端约300个核苷酸处的最大相关性(rho = 0.53,150mMAcIm)(图4F),表明RNA的5°末端可能不能通过该方法很好地分辨。在5- 0末端的差的结构分辨率可能是由于该区域的覆盖度降低,该区域的覆盖度降低是由不完全逆转录引起的,该不完全逆转录是由于存在可引起cDNA截短的AcIm加合物。使用纳米孔平台的直接RNA测序不严格要求逆转录;然而,已知cDNA的存在稳定了测序的RNA链,增加了总产率和通量,潜在地有利于回收具有退火的全长cDNA的RNA分子。nanoSHAPE促进RNA结构建模我们使用nanoSHAPE和SHAPE-MaP反应性作为引入最近邻RNA折叠算法的伪自由能约束进行二级结构建模两种结构模型的不同之处在于,与基于SHAPE-MaP的结构相比,nanoSHAPE质心结构包括更少的长程碱基对,并且具有更大的环尺寸(特别是对于发夹17和19 a)(图5A)。基于SHAPE-MaP和无约束建模,预测发夹17和19 a都在其环的基部朝向30侧具有内部凸起(U151和G435- U437)(图S11B)。46通过nanoSHAPE观察到的这些位置处的反应性,其特征在于30-至-50读取方向,可能过度检测反应性,闭环碱基对,导致预测更大的环尺寸。重要的是,SHAPE-MaP和nanoSHAPE约束预测的质心结构都包含预期在17~ 92簇中出现的6个接下来,我们对由SHAPE-MaP约束的和纳米SHAPE约束的pri-miR-17~ 92序列产生的RNA结构进行了配分函数计算。所有可能的核苷酸(i,j)之间的配分函数碱基对概率通常表现出一致的连接模式,表明集体预测的结构系综之间的广泛一致性(图5B)。然后,我们基准最小自由能和质心二级结构预测从nanoSHAPE与预测从SHAPE-MaP约束建模相对于没有探测数据(NPD)获得的模型。一般来说,Map-constrained模型是最独特的,与大量的先前工作一致,表明SHAPE-MaP数据通常会大幅改变RNA结构模型相对于NPD模型,在正确的结构方向。24,48nanoSHAPE数据也明显地扰动了结构系综,相对于NPD系综,变得更类似于SHAPE-MaP-知情模型(图5C)。我们得出结论,nanoSHAPE产生的pri-miR-17~ 92序列的反应模式和二级结构预测与基于高通量测序的RNA化学探测和结构分析方法大致一致。讨论ONT平台上的长读直接RNA纳米孔测序是在单分子水平上表征RNA的有前途的工具。RNA分子表现出不同的化学和结构状态,作为RNA功能,相互作用和动力学的效应器和调节器。我们试图使用RNA的直接测量,而不是cDNA拷贝,来检查RNA的化学修饰和二级结构。我们的直接RNA测序方法能够检测E. coli和革兰氏阳性菌S. 在核碱基(J)和骨架(Nm)两者处均存在酿酒酵母。这些位置中的大多数在我们比较内源性rRNA与体外转录对照的数据集中,我们用Tombo31和Nanopolish32进行了原始信号-序列比对,并鉴定了已知修饰位点±2 nt内的rRNA修饰位置。直接RNA纳米孔测序具有独特的定位,回答关于rRNA上修饰安装的动力学和排序的问题,并且原则上具有解决修饰的定量和长范围定相的潜力。信号辨别仍然是用于修饰检测的直接RNA纳米孔测序的突出挑战在所有可能的kmer序列背景下,将需要开发由已知修饰组成的训练集,用于RNA修饰鉴定,而无需与IVT对照进行比较。在没有IVT控件的情况下调用修改的能力,产量的直接RNA测序,应该允许Cell Genomics2,100097,2022年2月9日9会开放获取技术图5.基于SHAPE-MaP和nanoSHAPE反应性的RNA结构建模比较(A) pri-miR-17~ 92 RNA的二级结构模型,可视化为弧形图。显示了使用SHAPE-MaP(蓝色)或Nano-SHAPE(绿色)约束建模的结构的质心。组成miRNA发夹的二级结构模型显示有重叠的SHAPE-MaP和nanoSHAPE反应性。SHAPE数据对应于25 mM AcIm浓度。(B) 基于SHAPE-MaP(上图)或nanoSHAPE(下图)反应性约束的pri-miR-17 ~ 92中所有可能碱基对的概率,显示为配分函数点图。概率显示为-log10(概率基对(i,j))。(C) 结构模型的相似性,报告为相对阳性预测值(PPV)和最小自由能(MFE)和质心结构的灵敏度。在SHAPE-MaP约束(MaP)、nanoSHAPE约束和无探测数据(NPD)二级结构模型之间进行成对比较。研究其他丰度较低的细胞mRNA和长的非编码RNA。除了电流信号水平,我们还表征了直接RNA测序中电流水平停留时间的变化。核糖修饰,内源性Nm和外源性SHAPE试剂修饰,显著延长停留时间。由于RNA修饰在孔收缩的停留时间的变化最近已被报道。在此,我们证明了停留时间依赖于在距离孔收缩的记录距离(在5°方向上Xr~此外,我们观察到马达蛋白停留时间受一级序列的影响。使用Hel308马达蛋白和MspA纳米孔,已经显示易位速率对于DNA是序列依赖性的。我们发现平均移位率在纳米孔阵列中变化(图S16),使阵列通道中停留时间的直接比较复杂化。然而,我们认为,在直接RNA纳米孔测序实验中观察到的大停留时间可用于在不存在IVT对照的情况下推断Nm或J修饰的位点(在Xr距离处),前提是假定修饰周围的序列背景不是富含G的。要充分表征和整合这种额外的信息维度,需要通道--甚至是阅读--特异性标准化以忠实地比较跨纳米孔阵列的易位率。rRNA中天然存在的Nm修饰的检测表明,应用这种方法来检测实验引入的20-O加合物的可能性,如在RNA结构探测方法中使用的我们成功的关键是确定了专门为纳米孔测序定制的SHAPE试剂。AcIm具有有利的性质,包括短的(但仍然是实验上可管理的)半衰期、小的加合物尺寸、通过突变谱的检测和商业可用性。通过用AcIm修饰RNA产生的小加合物(2-O-乙酰基)在直接RNA纳米孔测序实验中是高速率的AcIm修饰确实降低了全长读数的数量、总产率和比对率;然而,结果产率和数据质量大大优于用产生更大加合物的试剂获得的结果产率和数据质量。与我们的分析一致,独立地发现NAI类似物(NAI-N3)诱导产量急剧下降。在这项工作中,NAI-N3在RNA的可读部分上产生了1%-2%的命中率,而AcIm在全长单分子上实现了高达11%的中值命中率。将nanoSHAPE与AcIm应用于pri-miR-17~ 92转录物的结构分 析 表 明 , nanoSHAPE 数 据 约 束 建 模 产 生 的 RNA 结 构 与SHAPE-MaP数据获得的结构大致相似。10Cell Genomics2,100097,2022会开放获取技术该研究直接RNA纳米孔测序,以及通过扩展的纳米SHAPE,具有局限性。该方法需要高浓度的靶RNA和游离的30-羟基用于连接到靶RNA上。50纳米孔所需的第一衔接子的磷酸盐测序亲电子SHAPE试剂,包括AcIm,共价修饰30-羟基,防止连接。我们通过化学处理来改善这一挑战,以产生磷酸三丁酯;修饰后,用磷酸酶处理RNA以使聚(A)加尾并连接到测序衔接子上。如果nanoSHAPE要适当地扩展到转录组范围内,并扩展到具有高单分子修饰率的细胞内结构探测实验,则可能需要用于选择和富集靶RNA以及保护细胞中的30-羟基(或富集具有可连接的30-羟基末端的分子)的新方法,以确保当前直接RNA纳米孔测序方法的足够产率。nanoSHAPE还受到较长RNA分子5°末端反应性分布这种分辨率的损失可能是由于多种因素,包括RNA纳米孔测序的30至50方向固有的覆盖偏差和通过高度结构化的RNA(如pri-miR-17~ 92)易位的困难。在我们的实验中,高度AcIm修饰的RNA上的cDNA合成也可能最后,nanoSHAPE受到用于识别内在转录后修饰和SHAPE加合位点的信号分析方法的限制在这项工作中,我们使用了一种比较方法,将修饰RNA的电流信号与相同序列的未修饰RNA的电流信号进行比较,以确定差异位点可以通过使用采用用于信号分类的训练模型的方法来改进修改检测。然而,从头方法依赖于在所有kmer序列背景下包含修饰的训练或基础事实集。加合物检测中的第二个挑战是区分真实的化学修饰与由潜在RNA结构诱导的电流信号和停留时间变化。用已知结构的天然RNA进行广泛的基准测试将告知加合物与结构效应的去卷积。尽管存在这些挑战,但nanoSHAPE显示出了巨大的前景。长读单分子测序将允许直接研究长RNA的RNA结构集合随着直接RNA纳米孔测序技术和分析的成熟,加合物检测和测序通量有望提高AcIm修饰的RNA的直接测序对于破译RNA能量景观、替代折叠途径和远端RNA结构元件的定相STAR+方法本文件的在线版本提供了详细的方法,包括以下内容:d关键资源表d资源可用性B电极导线触点B材料供应情况B数据和代码可用性d实验模型和子系统BE. coli和革兰氏阳性菌S. 酿酒酵母d方法样本BrRNA提取(E. coli和革兰氏阳性菌S. 酿酒)BrRNA IVT对照的生成B RNA的Poly(A)加尾B纳米孔文库制备B试剂BAcIm水解rRNA上的BBRNA修饰(pri-miR-17~ 92)pri-miR-17~ 92上的Bd量化和统计分析B纳米孔数据处理BNanopolish和Tombo数据分析BRNA结构建模B阳性预测值(PPV)和灵敏度补充信息补 充 信 息 可 以 在 www.example.com 上 找 到 https://doi.org/10.1016/j 。xgen.2022.100097。致谢这项工作得到了美国国立卫生研究院(HG010538)的支持W.T.和GM 122532至K.M.W.)。作者要感谢牛津纳米孔技术公司(NYC)的测序支持。此外,我们还要感谢Marcus Stoiber和Jared T。辛普森分别协助Tombo和Nanopolish。作者贡献概念化,W.S.;方法学W.S.,附言:W.T.,和K.M.W.;调查,W.S.;形式分析,W.S.,R.R.,S.B.,K.M.W.,W.T.; 资源,W.T. PS;写作-原始草案,W. S.,附言:W.T.;写作R.R.,W.T.,K.M.W.,PS;监督,W.T.,K.M.W.,PS;资助收购W.T. K.M.W.,另外申报利益W.T. 拥有两项授权给ONT的专利(8,748,091和8,394,584)W.S. 和W.T.在ONT组织的活动中发言的差旅费、住宿费和/或会议费报销。K.M. W是Ribomeirs的顾问并持有Ribomeirs的股权。投稿时间:2020 - 12 -修订日期:2021接受日期:2022发布时间:2022引用1. 吉尔伯特,W. V.,贝尔,助教,和Schaening,C.(2016年)。 信使RNA修饰:形式、分布和功能。Science 352,1408-1412.2. 姜杰,徐洪,和Chow,C.S.(2016年)。转录后修饰调节rRNA结构和配体相互作用。Acc. Chem. Res. 49,893-901.3. Eyler,D.E.,Franco,M.K.,Batool,Z.,Wu,M.Z.,Dubuke,M. L.,Dobosz-Bartoszek,M.,琼斯,J.D.,Polikanov,Y.S.,罗伊,B.,和Koutmou,K.S. (2019年)。mRNA编码序列的假尿苷化改变翻译。Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116,23068-23074.Cell Genomics2,100097,2022年2月9日11会开放获取技术4. Patil,D.P.,Pickering,B.F.,和Jaffrey,S.R.(2018年)。在转录组中读取m6A:m6A结合蛋白。Trends Cell Biol.28,113-127.5. Zaccara,S.,里斯,R.J
下载后可阅读完整内容,剩余1页未读,立即下载
cpongm
- 粉丝: 4
- 资源: 2万+
上传资源 快速赚钱
- 我的内容管理 收起
- 我的资源 快来上传第一个资源
- 我的收益 登录查看自己的收益
- 我的积分 登录查看自己的积分
- 我的C币 登录后查看C币余额
- 我的收藏
- 我的下载
- 下载帮助
会员权益专享
最新资源
- 藏经阁-应用多活技术白皮书-40.pdf
- 藏经阁-阿里云计算巢加速器:让优秀的软件生于云、长于云-90.pdf
- 藏经阁-玩转AIGC与应用部署-92.pdf
- 藏经阁-程序员面试宝典-193.pdf
- 藏经阁-Hologres 一站式实时数仓客户案例集-223.pdf
- 藏经阁-一站式结构化数据存储Tablestore实战手册-206.pdf
- 藏经阁-阿里云产品九月刊-223.pdf
- 藏经阁-2023云原生实战案例集-179.pdf
- 藏经阁-Nacos架构&原理-326.pdf
- ZTE电联中频一张网配置指导书
- 企业级数据治理之数据安全追溯
- MISRA-C 2012-中文翻译版.pdf
- 藏经阁-《多媒体行业质量成本优化及容灾方案白皮书》-37.pdf
- 藏经阁-浅谈阿里云通用产品线Serverless的小小演化史-23.pdf
- 藏经阁-冬季实战营第一期:从零到一上手玩转云服务器-44.pdf
- 藏经阁-云上自动化运维宝典-248.pdf
资源上传下载、课程学习等过程中有任何疑问或建议,欢迎提出宝贵意见哦~我们会及时处理!
点击此处反馈
安全验证
文档复制为VIP权益,开通VIP直接复制
信息提交成功