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SARS-CoV-2刺突蛋白的变构靶向及药物筛选
医学信息学解锁21(2020)100451千方百计:SARS-CoV-2刺突一种位于推定可用药位点的蛋白质破坏了受体结合域处的人血管紧张素转换酶相互作用菲萨约河Kehinde,OlotuMahmoud E.S. Omolabi索利曼*分子生物计算和药物设计实验室,健康科学学院,夸祖鲁-纳塔尔大学,韦斯特维尔校区,德班4001,南非A R T I C L EI N FO保留字:SARS-CoV-2刺突蛋白变构靶向虚拟高通量筛选受体结合域高亲和力结合A B S T R A C TSARS-CoV-2通过其Spike(S)蛋白介导的系统性进入宿主细胞对于人类的致病性是非常必要的。因此,靶向病毒进入机制仍然是COVID-19治疗的主要策略。尽管最近的努力集中在直接抑制S蛋白受体结合结构域(RBD)与人血管紧张素转换酶2(hACE 2)的相互作用,但变构靶向仍然是未探索的可能性。因此,在本研究中,我们首次采用综合荟萃分析方法研究了SARS-CoV-2 S蛋白的变构抑制机制及其与hACE 2的关系。结果显示,两个可药用位点(位点1和2)位于N-末端结构域(NTD)和S2区的蛋白质。通过针对约1500种FDA批准药物的库进行定点高通量筛选,发现了两种高亲和力结合剂:ZINC 3939013(Fosaprepitant-有趣的是,我们观察到两种化合物的变构结合扰乱了融合前S蛋白构象,这反过来导致了前所未有的hACE 2从RBD的置换。由于靶位点处的高亲和力相互作用,两种化合物的估计ΔG结合 此外,位点1残基; R190、H207、K206和K187、I101、R102、I119、F192、L226、V126和W104被鉴定为在ZINC 3939013的结合和稳定性中起关键作用。同样,Q957、N953、Q954、L303、Y313、Q314、L858、V952、N953和A956的能量分布证实了它们对ZINC 27990463在预测位点2结合的重要性。我们相信这些发现将为基于结构的SARS-CoV-2 S蛋白抑制剂的发现铺平道路,用于COVID-19治疗。1. 介绍新型冠状病毒疾病也称为COVID-19,由SARS-CoV-2(严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型)引起,于2019年12月在中国武汉首次报告发病[1]。然而,这种疾病一直持续到2020年中期,在212个国家传播,报告了超过3,513,507例病例,加上全球伤亡人数超过245,544人。SARS-CoV-2是一大组已知可引起呼吸道感染和相关并发症的冠状病毒。这些RNA病毒是球形的、多形性的、正感应的、单链的和多腺苷酸化的[3]。在所有已知的病毒中,冠状病毒(CoV)具有最大的RNA基因组[4],在动物和人类中具有不同的致病作用。该病毒类别分为四个属,即:α-CoV,β-CoV、γ-CoV和δ-CoV [5-7 ],其中β-CoV类因其在人类中的致病作用而突出(HCoV)。迄今为止,已经对7种HCoV进行了表征[6-另一方面,MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2引起严重的呼吸道和胃肠感染,在大多数情况下,这些感染可能是致命的[11]。尽管SARS-CoV相关感染是通过人畜共患传播到人群中的[12,13],但人与人之间的传播进一步促进了病毒通过呼吸道气溶胶的超级传播[14]。SARS-CoV-2的进入及其在靶人类细胞中的复制过程是通过组成病毒的一组组分(主要是非结构蛋白和结构蛋白)的功能来实现的。通常,约16种非结构蛋白(NSP)介导* 通讯作者。电子邮件地址:soliman@ukzn.ac.za(M.E.S.Soliman)。网址:http://soliman.ukzn.ac.za(M.E.S.Soliman)。https://doi.org/10.1016/j.imu.2020.100451接收日期:2020年7月22日;接收日期:2020年10月11日;接受日期:2020年10月11日2020年10月16日网上发售2352-9148/©2020的 作者。发表通过 Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页:http://www.elsevier.com/locate/imuF.A. Olotu等人医学信息学解锁21(2020)1004512如先前报道的,多种促致病功能,例如基因组框架的复制、加工和校对,宿主免疫逃避等[15更重要的是,CoV包含四种主要的结构蛋白,它们是其发病机制的组成部分[18它们是核衣壳(N)、包膜(E)、膜(M)和刺突(S)proteins. N蛋白构成核衣壳和其他病毒基因组相关过程[21],而M蛋白是四种蛋白中最丰富的,在维持病毒结构完整性以及协调其他结构蛋白方面发挥主要作用[22]。另一方面,E蛋白对病毒的成熟至关重要[23-两个结构域组成S蛋白,即N-末端S1结构域和C-末端S2-膜锚定结构域。S2区在CoV中广泛保守,而组成S1区残基在CoV毒株中高度分化[29]。由于与宿主受体识别和结合(S1)相关的特异性功能,以及与膜融合和进入(S2)相关的特异性功能,这些结构域已被进一步表征为亚结构域(图1)。与SARS-CoV结构类似,一些最近的报道将SARS-CoV-2S1胞外结构域细分为N-末端结构域(NTD),一种识别人血管紧张素转换酶2(hACE 2)的保守受体结合结构域(RBD)[30],以及亚结构域1和亚结构域2。2(SD1和SD2)。在感染期间,S蛋白的蛋白水解切割或引发对于病毒融合和进入宿主细胞是至关重要的,这是由宿主细胞蛋白酶如跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS 2)和组织蛋白酶L [31-S蛋白在裂解前主要存在于亚稳态融合前复合物中,裂解后发生显著的构象排列,以将病毒膜融合到宿主细胞中[37此外,RBD采用不同的构象运动来接合宿主细胞受体[40,41]。这些构象状态是短暂的,称为上(开放)[ 42][44][向上构象对应于hACE2可接近状态,而向下状态不能接合宿主细胞受体[44]。另一方面,S2结构域由功能上重要的融合肽(FP)组成,其对于病毒的感染至关重要。融合和融合后复合物的形成;七肽重复序列1和2(HR 1和HR 2);跨膜结构域(TM)和胞质尾区(CT)。S蛋白三聚体的HR相互作用以形成六螺旋束的融合核心,其有助于使病毒和宿主细胞的膜紧密接近以进行融合和进入[42]。因此,SARS-CoV-2 S蛋白的作用使其成为重要的治疗靶点,这将能够阻止病毒进入宿主细胞并在宿主细胞中融合。在过去的几个月里,已经报道了许多关于阻断SARS-CoV-2 S蛋白和hACE 2之间直接相互作用的可能性的研究。这些研究中的大多数旨在用抗体、基于肽的化合物或小分子化合物靶向S蛋白RBD结构域,这些化合物以高得多的亲和力结合以阻断S蛋白-hACE 2相互作用[45此外,在最近的一项研究中探索了靶向宿主蛋白酶如TMPRSS 2,从而阻碍SARS-CoV-2进入[30]。融合前S上其他功能(变构)位点的鉴定该蛋白可能是另一种动态和有效的预防SARS-CoV-2感染性的方法,相对于其与宿主细胞ACE 2和蛋白酶的相互作用。SARS-CoV- 2 S蛋白的这种替代靶向方法很重要,因为其RBD(与其他CoV相似)与高突变倾向相关,这反过来可能改变小分子抑制剂或设计用于结合其中的肽的亲和力[51]。在最近的一项研究中探索了变构靶向,其中CoV保守的S2 HR1区被鉴定为用于开发人CoV的广谱抑制剂的重要靶位点。对所得肽抑制剂(EK1)进行了体内评价,并显示出理想的安全性和有效性[52]。此外,蛋白质接触网络(PCN)模式被用来定位SARS-CoV上的功能变构基因座 S蛋白[53]。相对而言, 这 研究 是 实施 到 (一) 识别潜在SARS-CoV-2S蛋白的S1和S2结构域中除RBD-hACE 2界面之外的可用药位点(ii)针对最可用药位点对~1500种FDA批准的药物进行高通量(虚拟)筛选(iii)研究化合物的结合动力学和相互作用机制以及它们对S蛋白RBD-ACE 2复合物的相应影响。我们相信这项系统的研究将能够提供结构和分子的见解可能变构位点的SARS-CoV-2SFig. 1. SARS-CoV-2 S蛋白和靶向人ACE 2(蛋白酶结构域)的结构架构。A. SARS-CoV-2 S蛋白的结构拓扑图,显示其不同组分。NTD,N-末端结构域; RBD,受体结合结构域; SD 1,亚结构域1; SD 2,亚结构域2;S1/S2,弗林蛋白酶切割位点1; UH,上游螺旋; L,接头区;B. 融合前(S1/S2)S蛋白和宿主hACE 2相互作用(蛋白酶)结构域的3D结构(灰色)。F.A. Olotu等人医学信息学解锁21(2020)1004513适合于选择性靶向和基于结构的设计的蛋白质。这将为开发具有破坏S蛋白RBD处hACE2相互作用潜力的变构抑制剂开辟途径。2. 计算方法学2.1. 蛋白质修复和制备SARS-CoV-2 S-蛋白(融合前)的三维结构从PDB检索,条目为6VSB[44]。如前所述,这代表了S-蛋白RBD构象处于其向上(开放)状态,其最适合于hACE 2结合。此外,为了模拟融合前SARS-CoV-2 S蛋白(S1/S2)和hACE 2之间的结合相互作用,使用PDB条目6 M0 J的[54]这是另一种情况。该复合物描述了SARS-CoV-2 S-蛋白的RBD结构域(截短的)与hACE 2的蛋白酶结构域(PD)之间的结合。去除与本研究无关的共结晶分子,同时使用MODELLER算法填充结构中缺失的残基(间隙)[55]。该制备在UCSF Chimera图形用户界面(GUI)上进行[56]。其次,使用结构叠加方法,我们能够模拟融合前S蛋白(S1/S2)单体(RBD -向上构象)和hACE 2蛋白之间的复合物(图11)。 2)的情况。2.2. 变构位点使用先前报道的方法预测了SARS-CoV-2 RBD界面以外的可能的可用药位点[57在此,我们采用了多种工具进行网站识别和验证,包括SiteMap [61] , Fpocket [62] , Discovery studio 2016 Client [63] 和Prankweb [64]。SiteMap是一种详尽的工具,其基于诸如可药用性、表面暴露、疏水性和亲水性等特性对蛋白质口袋进行排名[65然后使用这些细节来表征预测的口袋,之后补充使用其他预测算法进行交叉验证。然后选择两个排名较高的研究中心进行进一步分析。2.3. SARS-CoV-2 S蛋白变构位点进一步研究的基本原理,我们在靶蛋白上绘制了两个最可药物化的位 点 , 并 针 对 它 们 虚 拟 地 筛 选 了 来 自 ZINC 储 存 库(http://zinc.docking.org/substances)的FDA批准的药物的大型化学库(约1500种化合物/subsets/fda/)。该筛选使用高性能计算集成的Autodock工具[68]进行,在此之前,使用网格Xes绘制预测位点的坐标。从得到的.pdbqt文件中检索相应的结合评分,并用于过滤每个预测位点1和2的最高20种化合物。随后,选择具有最高结合分数(最负)的两种化合物用于产生复合物的两个预测位点,所述复合物经受进一步模拟研究。如2.1中所述,融合前S蛋白(配体结合和未结合)与RBD-hACE 2复合物(6 M0 J)叠加,然后去除单个截短的RBD。通过这样做,我们获得了变构结合和未结合的融合前S蛋白-ACE 2复合物的模型。这一点,在这项研究中的目的,将提供结构和动力学的见解变构靶向SARS-CoV-2主机进入机器的机制的影响。2.4. 分子动力学(MD)模拟虽然计算昂贵(1673个残基),但我们使用其嵌入式模块在AMBER18图形处理单元(GPU)上对系统进行了长时间尺度MD模拟运行[69]。使用FF14SB力场定义蛋白质参数,而用前室和parmchk模块生成配体参数同样,LEAP程序用于定义坐标和配体结合和未结合蛋白质复合物的拓扑文件。 该程序还用于中和(添加抗衡离子; Na+和Cl-)和溶剂化10 μ m大小的TIP 3 P水箱中的系统。结构最小化首先进行了部分5000步骤与500千卡/摩尔的限制潜力,然后再100000步骤的完全最小化,没有限制。一个典型的(NVT)采用5 kcal/mol的谐波约束,在50 ps的时间内从0逐渐加热到300 K,在恒定的300K温度下平衡10000 ps,图二. 本文用于获得融合前S-蛋白-hACE 2复合物的建模方法的结构描述。A.从PDB(ID 6VSB)B检索的融合前SARS-CoV-2 S蛋白的3D结构检索截短S蛋白RBD和hACE 2(PDB ID 6M0J)C的3D结构。融合前SARS-CoV-2 S-蛋白和hACE 2的模拟复合物,通过A和B的结构叠加获得,然后去除截短的结构域。F.A. Olotu等人医学信息学解锁21(2020)1004514在《不扩散条约》总体框架内的限制。用Berendsen恒压仪将大气压保持在1巴[70],同时使每个蛋白质系统经历350 ns的生产运行。研究的系统包括ZINC 3939013-S-蛋白-hACE 2(变构位点1)、ZINC 27990463-S-蛋白-hACE 2(变构位点2)和未结合的S-蛋白-hACE 2。在每1ps时间帧保存相应的轨迹,直到模拟结束,然后使用Microcal Origin软件进行数据图分析[71]。还拍摄并分析了快照,以监测UCSF Chimera用户界面(GUI)和Discovery Studio Client上轨迹的结构事件和配体相互作用动力学[63]。2.5. 结合自由能和每残基分解的计算分子力学/广义玻恩表面积(MM/ GBSA)方法用于评估预测的变构S-蛋白结合剂在其靶位点的结合亲和力。两种化合物的结合能谱,包括其能量组分,使用来自MD轨迹末端30ns的1000个快照进行估计,其中构象稳定性可见。这种方法是重要的,以尽量减少构象紊乱或熵对配体相互作用的影响。下面的等式在数学上表示结合能计算:ΔG结合=G复合物-(G受体+G抑制剂)(1)ΔGbind=ΔGgas+ΔGsol- TΔS=ΔH-TΔS(2)ΔGgas= ΔEint+ ΔEele+ ΔEvdW(3)ΔGsol=ΔG ele,sol(GB)- ΔGnp,sol(4)ΔGnp,sol= γSASA+β(5)如图所示,内能(ΔEint)、静电能(ΔEele)和范德华能(ΔEvdW)合计为气相能(ΔGgas),而溶剂化自由能(ΔGsol)由极性溶剂化(ΔGele,sol)和非极性溶剂化贡献(ΔGnp,sol)项定义。采用MM/GBSA方法估算了当表面张力与溶液的表面张力成正比时,Δ Gele,sol的广义Born(GB)常数(γ=0.0072 mol-1 ~(-2))、溶剂可及表面积(SASA,表1用β常数求解ΔGnp,sol.此外,估计的ΔG结合被分解成单个残基能量,尤其是那些构成预测的配体结合的变构口袋的残基能量。该方法对于鉴定对潜在变构抑制剂的稳定性和抑制活性起关键作用的特异性残基至关重要。3. 结果和讨论3.1. 融合前SARS-CoV-2 S蛋白上潜在的变构位点鉴定、交叉验证和特性鉴定基于研究原理,我们着手确定除RDB结构域之外的可能的靶蛋白药物位点,据报道,RDB结构域与hACE 2发生相互作用。使用上述工具进行预测和交叉验证,结果显示相应的残基(结构域)。这代表了用于鉴定、验证和交叉验证SARS-CoV-2 S蛋白中可能的可药物化的变构位点的组合方法。 根据多重预测,位点1需要构成SARS-CoV-2 S-蛋白的NTD(7-307)的残基这些袋的结构如图3所示。此外,定义靶蛋白上的位点的可药物化性取决于大小(体积)和疏水性(具有最小的亲水性),而另一方面,高亲水性、降低的疏水性、小口袋大小和浅度表征“难以药物化“和不可药物化的口袋[ 61,65-67 ]。虽然大的亲水性可能对结合位点处的配体移动性具有排斥作用,但小或浅的空腔将阻碍配体接近、适合性、最佳结合和稳定性。更重要的是,>0.83(Halgren Dscore)阈值适用于可药物化研究中心[61],而SiteScore的截止点为0.8,这是用于区分可药物化和不可药物化的研究中心的参数。根据我们的结果,本文采用的四种预测算法通常识别和排名靶蛋白上的特定区域,表明它们作为变构位点的可能性。如前所述,前两个排序位点的组成残基对应于融合使用多种预测算法鉴定和交叉验证SARS-CoV-2融合前S蛋白上潜在的变构位点预测的结合位点预测和交叉验证网站SiteMap Fpocket DS 2016 Client Prankweb蛋白结构域三一五、三一七、六三一、六三二NTD,N端结构域; FP,融合肽; HR 1,七肽重复序列1; CD,连接域; RBD,受体结合结构域; SD 2,亚结构域2; SD 1,亚结构域1; CH,中心螺旋; βH- β发夹; TM,跨膜区。位点165,66,95101、103、104、108、109、142、143、92,93,94,95,96,97,98,99,101,102,99,101,102,104,119,新台币201,203,204,205,206,211,144、145、146、147、178103,104,105,106,117120、121、126、172、173、二二一二二二二二三170175,177,190,192,203,二二四,二二五205位点2731-737、791705-713、720、789、792、793、794、726,727,822828,833,837,854,856,FP、HR1、CD823807,832,833,834,835,836,837,856-858,859,860,956,959,959、962-968840,848,852九六零,九六三947-960位点318,19,20,21,22,23,5313,28,47,50,51,53,54,57,317,37,38,39,40,41,42,51,52,53,54,50,51,52,273,274,291,NTD、RBD、SD1位点4288-363,364,365,366,367,368,三百一十八,三百七十二355,380,396,398,412,423,425,55,195-204326,327,328,329,330,331,357,292,298,301,302,304,355-360、396、398、425、RBD,SD1369,370,382,383,385,426,429,430,431,432,433,464,358,359,360,361,362,363,四二六四二九四三零四三一四三三423512、513、514、515、516、518380464、466、514、515、516513-位点5596-603、660769、774、797、798、800、882、883、719-734、769729,730,731,774,775,SD 1、CR、HR 1F.A. Olotu等人医学信息学解锁21(2020)1004515--==-==-图三. 预测SARS-CoV-2 S蛋白的变构位点及其位置。A. SARS-CoV-2融合前S蛋白的3D结构,显示预测位点1和2的表面表示。B. 仔细观察ZINC 3939013的预测位点1、组成残基和起始方向。C. 插图显示ZINC 27990463的预测位点2、组成残基和结合方向。肽(FP)、七肽重复序列1(HR 1)、连接区/结构域(CR/ CD)和N端结构域(NTD)。根据表2,部位1→ 3的等级高于0.83 Halgren D评分阈值,使其适合于治疗靶向。相对而言,部位1似乎是高度表面暴露的,得分为0.933,而部位2的大袋尺寸和体积可能有利于使用大分子化合物。总之,位点1和2的高表面暴露加上相对大的体积、疏水性和有利的供体/受体性质可以解释它们作为S蛋白上除RBD之外的靶向变构区域的适合性(图3)。这些假设也反映在估计的Dscore和SiteScore值中。此外,由于这些预测的位点是高度功能性的,特别是重叠的FP、HR 1和CR,靶向它们可以破坏与SARS-CoV-2融合到宿主细胞中相关的结构事件,如最近文献中明确报道的[39,41,44,54,72]。3.2. 预测位点1和2的潜在变构结合剂的高通量筛选和鉴定使用约1500个FDA批准表2药物化合物(http://zinc.docking.org/substances/subsets/fda/)针对两个预测的变构位点进行Autodock网格框x以坐标为中心(中心、大小、X107.1、14.45岁99.65,16.33,z114.74,15.82),以及(中心、尺寸、x129.2,17.84;有85.23,24.15,z139.11,18.47)站点2.位点1和位点2的结合评分最高的前20种化合物的结果分别见补充表S1和补充表S2。根据筛选结果,估计研究中心1的ZINC 3939013(10 kcal/mol)和研究中心2的ZINC 27990463(9.3 kcal/ mol)的总体最高评分。3.3. 变构靶向破坏RBD如我们的方法中所强调的,对在两个潜在的变构位点处明显结合的融合前S-蛋白-hACE 2复合物进行MD模拟。这 方法 是 基本 到 探讨 的 可能 的影响基于位点属性的SARS-CoV-2融合前S蛋白预测变构位点的表征预测站点药物敏感性评分(Dscore)SiteScore表面-暴露口袋大小袋体积(A [3])疏水性亲水性氢供体/受体位点10.8930.9350.933482245.820.1680.3360.875位点21.0460.8990.794503294.310.2430.2031.922位点30.8420.8230.862319208.60.1420.8221.886位点40.8030.8170.852263214.300.1110.6132.539位点50.7380.8010.800218148.80.3530.7051.294位点60.7110.7860.696267237.640.3920.8840.634F.A. Olotu等人医学信息学解锁21(2020)1004516通过宿主hACE 2对SARS-CoV-2进入/融合机制的变构靶向。首先,我们监测了与化合物A和B在预测的SARS-CoV-2 S蛋白位点1和2处的变构结合相关的构象事件。这是通过从选定的时间范围内的MD轨迹获得快照,然后与其起始结构进行视觉比较来完成的。我们的研究结果表明,未结合的S-hACE 2复合物在模拟时间内保持完整,而hACE 2在约50 ns后逐渐从S-蛋白结合的RBD界面中被置换。研 究 中 心1 的 ZINC 3939013( Fosaprepitant ) 和 研 究中 心 2 的 ZINC27990463(Lomita- pide)(图4和5)。这些变化,诱导的变构粘合剂,进行更突出,直到模拟结束。如图所示,未结合的S-蛋白的RBD表现出相对然而,这种构象出现扭曲的变构结合的S-蛋白质,并可以解释从RBD接口的相互作用hACE 2的位移运动。因此,本文报道的SARS-CoV-2 S蛋白RBD的变构介导的破坏及其与hACE 2的相互作用是一个主要的发现,见图4。RBD处S蛋白hACE2结合的变构破坏。插图A-D示出了RBD(红色)及其相关的hACE 2(灰色)在300 ns下沿着从开始到最终结构的模拟周期的惯性运动。插图F.A. Olotu等人医学信息学解锁21(2020)1004517图五. S蛋白RBD的系统性扰动。插图见图6。未结合和结合(红色和绿色)系统中S蛋白和相应hACE 2的相对结构稳定性。A和AB和BF.A. Olotu等人医学信息学解锁21(2020)1004518表明变构靶向在SARS-CoV-2治疗中的可行性。此外,我们使用RMSD度量测量了配体-蛋白质复合物相对于未结合系统的结构稳定性。如图6所示,未结合的S-蛋白的结构不稳定性最高,而其相关的hACE 2与变构结合的S-蛋白相比相对稳定,变构结合的S-蛋白表现出重新结合。导管 在整个模拟时间内的Cα偏差(RMSD 2 μ s)。有趣的是,结合蛋白的hACE2显示出更高的结构运动,并可能与它们远离RBD的位移运动相关,如前所述。相比之下,变构配体结合在这两个网站明显降低RMSD的S-蛋白和诱导高RMSD的hACE 2。这可能表明变构靶向对S蛋白及其与hACE 2相互作用的结构影响。如表3所示,估计的平均RSD证实了未结合和结合蛋白复合物之间的构象变化。为了在我们的计算中最小化结构无序(熵)的影响,我们从MD轨迹中选择了系统似乎相对稳定的终端时间帧(270- 300 ns)。这些定义为最终平衡(FE)时间范围,并用于后续结构分析(表3)。从所得FE-RMSD图中,未结合的S蛋白高度不稳定,而其相关的hACE2显示出与RMSD计算一致的低结构运动,这也可能意味着S蛋白的结合稳定了hACE 2。相比之下,变构结合的S蛋白(位点1和2)显著稳定,而它们相应的hACE 2显示出高度的结构不稳定性,这可能与它们在S蛋白RBD处的系统运动相关,如前所述。此外,我们还测量了它们中蛋白质的Cα迁移率。通过计算它们的相对FE-RoG来确定结合和未结合形式。从补充图S1中的图中,我们观察到未结合的S蛋白中原子运动率明显较高,而其相应的hACE 2保持稳定运动,相反,在变构结合系统中原子运动率显著较高。这也与FE-RMSD分析一致,其共同表明hACE 2中与变构结合的S蛋白相关的高Cα迁移率可能是其在S蛋白RBD处运动的结果然后,我们研究了S蛋白RBD处的Cα运动,因为据报道该区域对于hACE2结合至关重要[54,72]。 FE-RMSD计算显示,在未结合的S-蛋白的RBD处具有明显的稳定性(RMSD 2 μm),而高结构运动或不稳定性特征-<变构结合S蛋白的化RBD。这证实了先前在化合物A和B结合的S蛋白的RBD处报道的高度扭曲。据推测,SARS-CoV-2 S蛋白的变构靶向或抑制扰乱了与宿主ACE 2相互作用所必需的RBD构象,导致最终解离。更重要的是,我们使用FE-RoG指标确定了各个RBD处的Cα迁移率程度。从得到的图中,未结合的S蛋白RBD表现出低Cα表3研究系统中相对构象变化的估计。运动,其在变构结合的S蛋白中增加(图7)。该观察结果与估计的FE-RMSD一致,其可以共同表明化合物的变构结合诱导构象变化,其可能改变了RBD处的hACE 2结合和稳定性然后通过使用稳定时间范围计算FE-RMSF值来监测蛋白质单位中组成残基的全身波动(图8)。结果表明,S-蛋白是,平均而言,较低的灵活性,在绑定系统相对于未绑定的,而高构象的灵活性的特点,相应的hACE 2蛋白在绑定系统。与早期的结果一致,结合S-蛋白中的hACE 2表现出的高结构波动可以指示相对于其在RBD的起始位置的动态变化的程度。我们还绘制了受体结合结构域(RBD)的平衡波动,RBD是S蛋白的一个重要组成部分,直接与hACE2相互作用。同样,除S2亚基外,还研究了CTD 2和CTD 3区域的残留波动(表4)。如补充图S2所示,未结合S蛋白的RBD区域表现出最小的波动,而变构ZINC 27990463结合在该区域诱导最高的波动。S蛋白的后S2结构域在未结合形式下高度波动,而异构结合降低了该区域的残留波动,特别是通过位点2的ZINC 27990463。在ZINC 3939013和ZINC 27990463结合的S-蛋白的SD 1和SD 2结构域处的残留波动也降低,这进一步表明变构抑制作用延伸到蛋白的关键部分。这可能提出变构SARS-CoV-2 S蛋白靶向作为破坏病毒进入人类宿主机制的可行策略。也 从 的 表 以上, 我们 可以 推断 可能的变构在一些实施方案中,S2是一种信号传导机制,其中位点1处的配体结合改变了相应的位点2区域(FP、HRI和CR),这些区域共同构成S2。这可以提供识别和表征靶蛋白内的变构通信网络的途径[73]。相应地,虽然未结合S蛋白的NTD和S2结构域之间的结构波动略有差异(~0.04 μ m),但位点1和位点2结合S蛋白的系统波动分别增加了0.34 μ m和0.11 μ m换句话说,在NTD处的配体结合减少了S2处的结构扰动,这与未结合蛋白质中的结构发生相反。3.4. 化合物A和B在预测的SARS-CoV- 2 S-蛋白变构位点使用MD轨迹的平均结构对SARS-CoV-2 S-蛋白的相应变构位点处的配体取向进行结构分析(图9)。结果显示,ZINC 3939013(福沙匹坦)的变构结合稳定在NTD。福沙匹坦含有末端三磷酸基团,其朝向残基如N99、K187、N188、R190和H207。同样地,其三氟甲基基团朝向D102,而组分-NH基团介导与Q173和N121等的相互作用。这些都可以促进高亲和力的相互作用,结构分析(英文)未结合加标物(hACE2)ZINC 393013加标物(hACE 2)ZINC 27990463加标物(hACE 2)其稳定性和对SARS-CoV-2和相关hACE 2的变构抑制作用。另一方面,ZINC 27990463的系统取向显示,整体RMSD 17.09 ±1.1(1.77 ±0.23)11.05 ±0.313.31± 0.9(1.93±0.9)0.32)9.57±0.4(1.87±)11.00±2.0(2.2 ± 0.4)7.61±1.4(2.6 ±0.1)它在初始时间范围内横穿预测的位点2和相邻的NTD-RBD接头(L)。在化学上,ZINC 27990463(洛美他派)在其两个末端由两个三氟甲基组成,并且作为FE-RMSFFE-RoG(1.66±0.26)5.40 ±1.9(0.73±0.32)41.08 ±0.41(24.49±0.1)0.31)4.87±1.7(1.39±0.45)38.4±0.36(25.01±0.16)3.79±1.2(3.0 ± 0.82)36.9±0.61(26.0±)0.22)观察到,而末端三氟甲基部分(与氨基和羟基取代基一起)定向到由T732,T734,D830,F833,Y837,Q853,K854,N856,L858,T859,V860,第二个三氟甲基部分延伸至受体结合域FE-RMSD 4.1± 0.1 5.6±0.3 6.1 ± 0.2FE-RoG 15.3± 0.2 16.1±0.3 16.2 ± 0.2T302、L303、K310、I312和Y313。此外,HR1残基(N955、A956、L959、N960、L962、V963和K964)参与配体结合。这种跨结构域结合活性FE-RMSDF.A. Olotu等人医学信息学解锁21(2020)1004519见图7。与hACE2相互作用相关的未结合和变构结合S蛋 白 RBD 结 构 域 C α 运 动 的 估 计 。 A. 未 结 合 ( 黑色 ) 、 ZINC 3939013 结 合 ( 红 色 ) 和 ZINC27990463结合(绿色)S蛋白RBD的C α RMSD比较图。B. 未结合(黑色)、ZINC 3939013结合(红色)和ZINC 27990463结合(红色)的C α RoG比较图结合(绿色)S蛋白RBD。C. 未结合(黑色)、ZINC3939013结合(红色)和ZINC 27990463结合(绿色)S蛋白RBD处差异发生的结构变化的目视分析。这些结构是通过其所得平均结构的结构叠加获得的。见图8。C α FE-RMSF图显示未结合和配体结合的S-蛋白及其相应hACE 2s A之间不同的每残基运动和构象灵活性。未结合(黑色)、ZINC 3939013结合(红色)和ZINC 27990463结合(绿色)S-蛋白B的S-蛋白中每个残基的波动比较。其相应hACE2中的比较性 每残基波动。表4SARS-CoV-2 S蛋白未结合和变构结合形式结构组分的FE-RMSF计算。残差波动(残差)ZINC 27990463可能是其对S蛋白结构,特别是RBD的显著破坏活性的原因。3.5. 结合自由能和每残基贡献的估计结构域未结合尖峰ZINC3939013-尖峰ZINC27990463-尖峰化合物的结合亲和性使用MM/MIBI测定新台币1.35± 1.25 1.64±0.52 1.26 ± 0.6RBD 1.75± 0.7 1.9±1.24 2.14 ± 0.44标准差1 1.67± 0.39 1.53±0.44 1.35 ± 0.3SD 2 1.85± 0.49 1.72±0.67 1.19 ± 0.31S2 1.39± 0.89 1.30±0.66 1.15 ± 0.43PBSA技术,这也使我们能够测量预测的变构位点的相互作用残基的能量分布。如表5所示,使用相对稳定的时间范围(270- 300 ns)进行结果显示,两个靶位点都非常有利于配体结合,因为两种化合物都表现出有利的ΔG结合,为-52.7F.A. Olotu等人医学信息学解锁21(2020)10045110---------见图9。变构结合剂在预测的S-蛋白位点的结合方向在终端后平衡的时间框架。A-C示出了ZINC 3939013沿着时间帧270- 300 ns A '-C'在位点1显示了位点2结合的ZINC 27990463从270- 300 ns的模拟轨迹的跨域取向。表5配体-蛋白质复合物的结合自由能曲线能量组分(kcal mol-1)ZINC 3939013-部位1 ZINC 27990463-部位2ΔEvdW-49.93±0.21-43.19 ±0.15ΔEele-213.0±1.54 34.68 ±0.54ΔG气体-262.9±1.49-8.51 ±0.56ΔGele,sol(GB)214.2± 1.38-21.65 ±0.51ΔGnp,溶胶-7.5±0.01-6.4 ±0.02ΔG溶胶206.7±1.38-28.05 ± 0.51ΔH-56.2±0.19-36.56 ±0.26TΔS-3.5±0.02 3.99 ±0.1ΔG结合-52.7±0.26-32.57 ±0.17kcal/mol(中心1的ZINC 3939013)和32.57 kcal/mol(中心2的ZINC27990463)。这些估计进一步表明两个预测的位点作为高亲和力区域,用于实现SARS-CoV-2 S-蛋白的变构抑制。同样,从估计中,我们可以推断熵对ΔG结合的影响是最小的。此外,我们观察到,静电效应的贡献最显着的变构结合的ZINC3939013在NTD区域,而范德华贡献的ZINC 27990463在预测的网站2口袋的结合效果最高。位点1的静电分布可能是由于构成口袋的大量正电性残基,如图10所示,其可与化合物的负电性部分形成高亲和力相互作 用。 计 算进 一 步表 明, 在 气相 中 ,ΔEvdW 和ΔEele 更 有利 于ZINC3939013,而极性溶剂化能更有利于ZINC 27990463在S-蛋白的S2区。这可能意味着,虽然前者被埋在NTD的深疏水口袋中,但后者由于其疏水性而暴露于表面反式结构域结合活性,如先前报道的。为了了解在两个预测的网站的化合物的机械结合,我们分解成相互作用的残基的个人贡献的结合自由能。这些都与结构分析相结合,显示了所涉及的相互作用的类型和性质。从每个残基图中,我们观察到R190、H207、K206和K187的高ΔEele15.5 千 卡 / 摩 尔 ,11.90 千 卡 / 摩 尔 ,8.35 kcal/ mol 和 10.55kcal/mol,表明它们在稳定预测位点1的ZINC 3939013中的关键作用。R190和H207具有显著高的总能量贡献,分别为14.42 kcal/mol和5.3
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