基因治疗-半衰期延长增强腺相关病毒基因治疗的药物疗效

工程21（2023）203研究生物医学工程-文章半衰期延长增强腺相关病毒基因治疗的药物疗效吴慧芳a，胡丹a，李全晓a，王春雨a，朱晓义a，李伟b，陈斌凡a，季平a，黄可可a，黄爱玲a，黄景和a，Dimiter S.Dimitrovb，Yanling Wua，c，Yu，Tianlei Yinga，c，Yu复旦大学基础医学院上海传染病与生物安全研究所医学分子病毒学教育MoE/国家卫生健康委员会重点实验室，上海200032b匹兹堡大学医学系，匹兹堡，PA 15261，美国c上海合成免疫工程研究中心，上海200032阿提奇莱因福奥文章历史记录：2021年10月1日收到2022年2月6日修订2022年2月20日接受2022年3月22日在线提供保留字：基因治疗腺相关病毒半衰期2型糖尿病的A B S T R A C T延长基于蛋白质的治疗剂的半衰期可以提高药物功效。然而，药物半衰期对基因治疗的影响仍然不清楚，基因治疗本质上提供了所需治疗蛋白质的持久生产。在这项研究中，具有延长的半衰期的几种蛋白质通过与可溶性单体免疫球蛋白G1（IgG1）可结晶片段（sFc）或IgG的Fc区融合在腺相关病毒（AAV）递送的基因治疗中进行工程化。已经证明，延长小尺寸双功能蛋白质和成纤维细胞生长因子21（FGF 21）的半衰期显著增加了它们在血流循环中的浓度。此外，AAV递送的FGF 21的半衰期延长导致2型糖尿病动物模型中肝损伤和血糖的显著降低，并改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性这些结果证明了基因治疗在治疗人类疾病中具有延长药物半衰期的治疗潜力。©2022 The Bottoms.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍目前，蛋白质疗法在全球已批准的药物和数千种正在临床开发的生物制药产品中占主导地位[1]。一些小的重组蛋白，如细胞因子和激素，在临床上用于治疗各种疾病。它们通过肾过滤从循环中迅速清除因为的他们的小分子大小（50 kDa）和短的终末半衰期（通常在数分钟至数小时的范围内）[2]。维持有效治疗浓度的一种方法是以高剂量和高频率给药。然而，这可能导致高初始峰值，随后是波动的浓度，这可能导致剂量和波动相关的并发症以及与患者依从性和成本增加相关的问题[3]。延长药物的半衰期是维持治疗浓度的更有效方法在*通讯作者。电子邮件地址：yanlingwu@fudan.edu.cn（Y.Wu），tlying@fudan.edu.cn（T.Ying）。近年来，为此目的已经开发了几种技术，包括聚乙二醇化、脂肪酸缀合、白蛋白融合以及与免疫球蛋白G（IgG）的片段可结晶（Fc）区的融合[4]。这些技术已经应用于广泛的蛋白质治疗，并且已经证明由于它们在循环中的半衰期延长而改善了它们的治疗功效。值得注意的是，即使药物半衰期延长，实现慢性疾病的长期治疗暴露也需要多个蛋白质剂量，这突出了对以商业上可行的方式将治疗剂递送至作用部位持续更长时间的或者，基因治疗将治疗性蛋白质的基因递送至靶细胞和组织，随后产生长期药物表达，因此代表了针对基于蛋白质的治疗中存在的挑战的可行解决方案[5，6]。 第一个基于腺相关病毒（AAV）基因递送方法的基因治疗产品被批准用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症[7]。在此之后，由于其相对理想的安全性和低整合倾向，AAV已成为临床试验中最广泛使用的基因治疗载体https://doi.org/10.1016/j.eng.2022.02.0092095-8099/©2022 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engH. Wu，D.胡角Li等人工程21（2023）203204·×······××·[8]《易经》云：“君子之道，焉可诬也？有始有终。然而，基因表达的功效需要改进以降低制造成本和治疗反应所需的施用剂量半衰期延长的益处已在传统的基于蛋白质的治疗中得到证实，然而，药物半衰期对基因治疗功效的影响很少受到关注[10为了评估延长药物半衰期在基因治疗中的作用，选择了两种具有短半衰期的生物制剂作为概念验证（小尺寸双功能蛋白质和细胞因子），并设计了几种具有不同循环半衰期的生物分子。值得注意的是，双特异性抗体（BsAb）-可溶性单体IgG 1可结晶片段（sFc）（n118-sFc-mD 1.22）和Fc-增加的药物浓度可以转化为改善的治疗功效，因为半衰期延长的FGF21的AAV递送导致肝损伤和血糖的显著降低，并且在两种不同的2型糖尿病（T2DM）模型中改善了葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。这些结果证明了基因治疗的治疗潜力，延长了药物半衰期，以促进治疗人类疾病。2. 材料和方法2.1. 动物所有动物程序均经复旦大学机构动物护理和使用委员会批准，并将动物饲养在22 ℃下具有12 h光-暗循环的房间中。雄性野生型（WT）BALB/c小鼠，6-8周龄，购自上海凌昌生物技术有限公司，有限公司（中国）。六周龄雄性糖尿病db/db（C57 BLKS/J-Lepr db/Lepr db）和非糖尿病db/m小鼠（C57 BLKS/J-Lepr db/+）购自GemPharmatechCo.，有限公司（中国）。db/db和db/m小鼠是从杂合育种中获得的同窝小 鼠 。 通 过 尾 静 脉 注 射 （ i.v. ） 施 用 重 组 腺 相 关 病 毒 血 清 型 8（rAAV8）。对于每个实验，基于体重将所有小鼠随机化。2.2. 蛋白质、质粒和细胞重组Fcc受体IIIa（Fcc RIIIa;分化簇16 a（CD 16 a）），n118，人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）包膜（Env）糖蛋白（gp 140）、工程化的单结构域可溶性CD 4（mD1.22）和sFc由我们的小组如前所述产生[16]。简言之，在大肠杆菌菌株HB 2151中表达CD 16 a结合单结构域抗体n118和工程化单结构域mD1.22，并使用Ni-NTA树脂（QIAGEN，Germany）纯化。将CD 16 A和gp 140基因克隆到pSecTag 2B载体中，在Expi 293细胞（Invitrogen，USA）中瞬时表达，并用Ni-NTA树脂纯化。将sFc基因克 隆 到pComb3x载 体 中 ，在 HB2151 中 表 达 ，并 使 用 蛋 白G 树 脂（ Roche Applied Science ， Germany ） 纯 化 。 中 国 仓 鼠 卵 巢 ZA（CHO-ZA）细胞购自Invitrogen。CHO-ZA-单链gp 160（gp 160sc）细胞系是我们在我们的研究中开发的稳定细胞系。在实验室中表达HIV-1gp 160，并在含有31.5μg/mL博来霉素和2 mmol mL-1谷氨酰胺。 表达CD16a的Jurkat T细胞是购自Promega（USA）。2.3. 融合蛋白的产生和纯化BsAb-sFc基因通过融合n118、sFc和mD1.22基因通过重叠延伸聚合酶链反 应 （ PCR ） 。 将 SfiI 消 化 的 BsAb-sFc 基 因 克 隆 到 含 有 His 标 签（HHHHHH）和FLAG标签（DYKDDDDK）的线性化pComb 3x载体中。将经sanger验证的载体转化至HB2151中。 将新鲜转化的菌落添加至5mL2在含有100μg/L氨苄青霉素和0.2%（w/v）葡萄糖的酵母提取物-酵母胨（YT）培养基中以250转/分钟（rpm）振荡3-在600 nm处达到0.6接着，将lmmol mL-1异丙基-1-硫代-b-d-（2-（三氟甲基）苯基）-2-（三氟甲基）氨基甲酸乙酯（100 mL）加入到反应体系中。添加吡喃半乳糖苷以诱导蛋白质表达，并将培养物在 30 °C 和250rpm下进一步孵育过夜。通过离心收集细菌，并根据制造商的说明书使用蛋白G柱纯化蛋白质。通过重叠延伸PCR将n118和mD1.22基因融合，获得n118-mD1.22基因。使用与BsAb-sFc相同的方案表达n118-mD1.22（BsAb）蛋白，并根据制造商的说明书使用Ni-NTA树脂纯化。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）验证蛋白质纯度，并通过荧光光度法（NanoVue; GEHealthcare，USA）测量蛋白质浓度2.4. 通过生物层干涉法（BLI）使用Octet-Red 96装置（Pall ForteBio，USA）通过BLI测量蛋白质（BsAb-sFc，BsAb）与gp 140或CD 16 a的结合动力学。CD 16 a或gp 140蛋白在浓度-在乙酸钠缓冲液中的30μg/mL的滤液被固定化第二代胺反应（AR2G）生物传感器并与在含有0.02%Tween 20的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的蛋白质稀释液一起孵育将蛋白质从500至0.69 nmol mL-1稀释三倍。实验如下进行（在37°C下）：①平衡步骤（10 min），②通过1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺活化AR2G（5 min），③加载步骤（5 min），用乙醇胺猝灭（5 min），猝灭基线步骤（5 min），蛋白质的猝灭缔合（5 min），和蛋白质的 猝 灭 解 离 （ 5 min ） 。 使 用 ForteBio 数 据 分 析 软 件 （ PallForteBio）拟合曲线2.5. 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）报告基因测定ADCC报告基因生物测定（Promega）用于评估融合蛋白的ADCC活性将编码荧光素酶报告基因的Jurkat T-CD 16 a细胞稳定表达HIV-1Env gp 160的基于CHO的细胞系（CHO-ZA-100）GP 160SC细胞）用作靶细胞。将靶细胞以2.5%的密度接种在96孔板上在 25μLRoswellPark Memorial Institute 1640 （ RPMI1640）培养基（Gibco，美国）。将融合蛋白从1lmolL-1的初始浓度连续稀释。接下来，以100 μg/ml的密度加入效应细胞。2.5在25μLRPMI 1640培养基中每孔10 μ L细胞。该测定使用Bio-Glo荧光素酶测定系统（Promega）和发光计数器（Infinite M200 Pro; TECAN，瑞士）。在不存在靶细胞或存在gp 160阴性CHO-ZA细胞的情况下与Jurkat T-CD 16 a细胞孵育的融合蛋白用作阴性对照。2.6. HIV-1中和试验通过将293 T细胞与pNL 4 -3、Luc、R-E-骨架和Env克隆共感染产生假病毒，并且在48小时后收获上清液，在376 ℃反应性离心，H. Wu，D.胡角Li等人工程21（2023）203205-·×····离心力（RCF）5min，并在80 °C下储存。产生一组19个Env克隆，并使用每种假病毒的200个地中海组织培养感染剂量（TCID 50）的标准接种物来测试两种中和蛋白（BsAb-sFc和BsAb）的效力和宽度。使用基于琼脂糖酶的测定评估假病毒中和使用五倍连续稀释，一式两份检测每种蛋白质计算每种蛋白的50%抑制浓度（IC50），以确定抗HIV-1效力。2.7. 药动BALB/c小鼠饲养在复旦大学（中国）的动物设施中。所有动物静脉注射0.5 mg蛋白质样品。在注射后6、8、10和12 h以及1、2、3、4和5 d通过眼眶出血使用酶联免疫吸附测定（ELISA）测定血浆蛋白浓度，标准曲线使用原始蛋白储备液和蛋白CD 16 a生成。2.8. 载体构建如前所述[17]，重组CD 16 a、BsAb、gp 140和BsAb-sFc由我们的小 组 产 生 ， 并 且 使 用 n118-forw 引 物 ：50-CCGGAATTC-GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT-30和mD1.22-forw引物：50-GAAGATCTTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCATGGTGATGGTGAT-30进行GATGGCCCACCACCAGCTGCAC-30. FGF21基因序列可见于参考文献[18]。通过GenScript合成FGF 21和Fc-FGF 21基因，并使用基因特异性引 物 进 行 扩 增 。引 物 包 括 FGF21- 正 向 引 物 ： 50-AGAATTGGATCGGCTAGCGGTACC-3 0 ， 和 FGF 21- 反 向 引 物 ： 50-GAGGTTGATTGTCGAAGATC-30。PCR反应在以下优化条件下进行在95 °C下退火3min，随后进行30个循环的95 °C下变性30 s，56 °C下退火60 s（或90 s），和72 °C下延伸30 s。扩增产物在1%琼脂糖上电泳并凝胶纯化。其次，根据基因的原理，同源重组后，使用一步PCR克隆试剂盒（Novoprotein，China）将BsAb、BsAb-sFc、FGF 21和Fc-FGF 212.9. 病毒生产通过293T细胞的三重转染和碘克沙醇梯度纯化产生rAAV8。简言之，用PEIpro转染试剂（Polyplus，法国）以与DNA 1：1的比例转染293 T细胞。以1：1：1摩尔比转染pHelper、RC 8和AAV8质粒。转染后72小时收集上清液和细胞，并使用先前描述的方法进行处理[19]。用50 U mL-1（U：单位）benzonase（30分钟，37 ℃），然后在离心管（BeckmanCoulter，USA）中进行碘克沙醇梯度（15%、25%、40%和60%）。然后在112 700 RCF下超浓缩4 h。收集40%级分，浓缩，在超滤管（UFC 910096; 100 kDa; Millipore，USA）中用1 PBS进行缓冲液交换，并用含有（0.1%、0.001%和0.0001%）pluronic-F68（BBILife Science，China）的水洗涤三次。rAAV 8在使用前储存在-80 °C下2.10. rAAV8定量和ELISA在纯化AAV 8后，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN）提取病毒DNA，并使用实时荧光定量分析仪定量时间逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR），其使用CFX 96实时系统（Bio-Rad，USA）与TB Green（一种发射绿色荧光的Takara BioDNA嵌入剂针对mD1.22或FGF 21设计引物（FGF 21-forwa引物：50-CAGCTGAAGGCCCTGAAGCCT-30;FGF 21- 反 向底 漆 ：50-CCTAAAAGAACAGGCCTCGGG-30;mD1.22- 正 向底 漆 ：50-ACCTGCACCG CCAGCCAGAAG-30;mD1.22-反向底漆：50-GCTCC TCCTGCTGTCC ACCCT-30）。使用ELISA试剂盒（RD Systems Inc.，美国）。2.11. 胰岛素耐量试验（ITT）和葡萄糖耐量试验（GTT）禁食6小时后，向小鼠腹膜内注射胰岛素（Novolin® R）或葡萄糖。对db/db小鼠使用2 IU kg-1（IU：国际单位）体重胰岛素或1 g kg-1体重葡萄糖，对饮食诱导的肥胖（DIO）小鼠使用0.4IU kg-1体重的胰岛素或1.5gkg-1体重的在注射后0、15、30、45、60、90和120分钟使用血糖仪（Yuwell，中国）测量血糖2.12. 血清学分析通过眼眶出血收集血液，并通过离心（2041 RCF，4 °C，10分钟）分离血清。使用自动生化分析仪（ADVIA XPT; Siemens HealthcareDiagnostic，Inc.，德国）。2.13. 肝脏生化分析在 使 用 匀 浆 器 （ ShanghaiBihengBiotechnologyCo. ， 有 限 公司、中国）。2.14. 全身定量计算机断层扫描为了可视化全身脂肪组织积聚和分布，包括皮下、内脏和棕色脂肪，进行全身微计算机断层扫描（CT）扫描。在老鼠身上一个详细的三维图像的内部使 用 高分 辨 率 X射线 CT 扫 描 （ QuantumFX;PerkinElmer ，USA）捕获小鼠的结构。 将小鼠用1.5%-2.5%异氟烷麻醉并定位在扫描平台上。 将X射线源设置为72IA的电流和90峰值千伏（kVp）的电压。扫描是从附近的计算机终端，每只鼠标持续4分钟。使用体积编辑工具进行图像分割，并使用软件包（AnalyzeDirect，USA）中的感兴趣区域模块对体积进行定量。使用Analyze 12.0软件计算脂肪含量和分布。2.15. 骨骼分析用CT评估骨体积和骨结构。将小鼠胸腺保存在PBS中，并使用eXploreLocusCT扫描仪（General Electric，USA）以36μm分辨率扫描。 将X射线源设置为88IA的电流和90kVp的电压。在胫骨近端1mm3处分析骨小梁骨骺使用MicroView 3D图像查看器和分析工具（AnalyzeDirect）计算骨参数。H. Wu，D.胡角Li等人工程21（2023）203206×× ××2.16. 统计分析所 有 数 据 表 示 为 平 均 值 ± 平 均 值 的 标 准 误 差 （ SEM ） 。 使 用SPSS17.0软件（SPSS，USA）进行统计分析在正态分布检验后，方差分析（ANOVA）用于组间比较和两个差异之间的多重比较（最小显著差异）。 差异认为统计学显著p< 0.05。3. 结果3.1. 抗HIV-1的治愈艾滋病毒/获得性免疫缺陷综合征（艾滋病）仍然是一个医学挑战，因为病毒在联合抗逆转录病毒治疗（cART）停止已经做出了大量努力来开发HIV-1的治愈，包括Xencor然而，当与cART联合使用时，这些方法在短期治疗环境中显示出相对延迟的病毒反弹。单次注射AAV转移的蛋白质可长时间抑制病毒的反弹，从而产生优异的治疗效果[23，24]。这一观察结果促使我们设计一种新的长效蛋白质，用于通过体内AAV递送改善治疗效果。首先，我们开发了一种针对HIV-1的双功能蛋白（图11）。1（a））。简言之，mD1.22是一种工程化的单结构域CD 4，对HIV-1gp 140具有高亲和力[25]，n118是一种来源于我们的噬菌体展示文库的全人单结构域抗体（数据未显示），可以高亲和力结合自然杀伤细胞上的CD 16 a。利用柔性的3GGGGS接头将mD1.22和n118融合，产生双功能蛋白，命名为BsAb。为了延长该蛋白质的半衰期（28kDa），同时保留对HIV-1上空间限制性表位的访问[26]，使用先前工程化的sFc产生双功能蛋白质BsAb-sFc。BsAb-sFc以高亲合力结合CD 16 a和gp 140两者，与BsAb的亲合力相似（图1B）。 1（b）和图。附录A中的S1（a））。值得注意的是，药代动力学结果显示，sFc融合双功能蛋白BsAb-sFc的半衰期达到21小时，这不同于从小鼠循环中快速去除的BsAb，表明其在体内提供更好保护的潜力（图1B）。 1（c））。此外，使用动态光散射评价蛋白质聚集趋势。结果显示，BsAb-sFc显示出比BsAb更高的溶解度和热稳定性（图1A和1B）。附录A中的S1（b）和（c））。SDS-PAGE还显示BsAb-sFc和BsAb在4 °C下7天相对稳定（附录A中的图S1（d））。此外，BsAb-sFc被证实为ADCC的有效介质（图1（d））。BsAb和BsAb-sFc均显示出对一组19种具有不同进化枝和地理来源的HIV-1假病毒的广泛和有效的中和活性（附录A中图1（e）和图S1（e））。总之，我们的发现支持BsAb-sFc作为潜在的抗HIV-1治疗剂。3.2. 通过AAV8递送的基因治疗接下来，探索了BsAb-sFc和BsAb用于基因治疗的潜力AAV 8经修饰以编码红色荧光蛋白（RFP;对照）、BsAb-sFc和BsAb的序列，其表达受CAG启动子控制（图1（f））[27]。AAV 8-RFP在Huh 7和HepG 2肝癌细胞结果表明，AAV 8-RFP能够成功感染细胞并表达RFP蛋白。此外，细胞的阳性率随着病毒剂量的增加而增加（图1（g），图2（g））。附录A中的S1（f）、（g）和S2（a））。因此，将不同剂量的AAV 8-BsAb和AAV 8-BsAb-sFc静脉内注射到BALB/c小鼠中。我们的结果显示，BsAb-sFc和BsAb的浓度与体内AAV 8的剂量正相关（图1A和1B）。1（h）-（j））。此外，BsAb-sFc浓度显著高于BsAb的浓度（图1A和1B）。1（h）-（j））。总体而言，延长AAV8表达蛋白的半衰期可以增加其体内血液浓度。用AAV 8-BsAb-sFc感染后，在不同时间检测小鼠血清中的抗BsAb-sFc抗体，结果显示抗BsAb-sFc抗体浓度不随BsAb-sFc蛋白浓度的增加（405 nm处的光密度（OD405）0.5）或时间增加（附录A中图S2（b））。此外，为了测试AAV 8-BsAb-sFc和AAV8-BsAb在体内的长期表达是否会导致器官损伤，使用苏木精和伊红（HE）染色分析最高剂量组中的小鼠的内脏。结果显示，在高剂量组的器官中未检测到病理学特征，证明了体内长期AAV8表达的安全性（附录A中的图S33.3. AAV8介导的基因治疗提高半衰期延长的FGF21的表达水平为了进一步验证我们的观察结果，开发了另一种基于AAV8的基因疗法FGF21是葡萄糖和脂质代谢的关键调节剂[28]，已成为T2DM治疗的有前景的治疗剂由于天然FGF 21的半衰期短（在小鼠中为30分钟，在猴中为2小时），已经做出相当大的努力来改善其药代动力学性质。例如，Hecht等人开发了长效FGF 21（RG）类似物。[18]第10段。FGF21（RG）蛋白含有2个点突变，即第98位亮氨酸替换为精氨酸（L98 R）和第171位脯氨酸替换为甘氨酸（P171 G）。然而，目前临床开发中的FGF 21类似物仍然需要定期给药以维持临床益处，这可能取决于患者的依从性并引起免疫学问题。在此，我们的结果表明，Fc融合显著延长了小鼠中FGF 21（RG）（下文称为FGF 21）的半衰期（附录A中图S4（a））。接下来，我们使用AAV 8载体将RFP（对照）、FGF 21和Fc-FGF 21基因以1 μ mol/L通过尾静脉递送至BALB/c小鼠。十十，一1011和1分别为每只小鼠1012个载体基因组（vg）（图2s（a））。在12周监测期间，AAV 8-Fc-FGF 21处理的小鼠的体重增加显著低于高剂量组中AAV 8-FGF 21处理的小鼠的体重（图1A和1B）。2（b）-（d）和图附录A第S4（b）-（d）段）。为了确定AAV 8是否延长FGF 21的半衰期，测量FGF 21和Fc-FGF 21的血清浓度。结果显示，三个剂量组中Fc-FGF 21的血清浓度显著高于FGF 21的血清浓度（图1A和1B）。2（e）-（g））。循环Fc-FGF 21和FGF 21的增加主要是由于肝脏中的转基因表达（图1A和1B ） 。 2 （h ） - （ j ） ） 。 重 要 的 是 ， Fc-FGF 21 的 信 使 RNA（mRNA）水平低于FGF 21的信使RNA（mRNA）水平。高剂量组和低剂量组。这些结果进一步证明，延长由AAV 8表达的FGF 21的半衰期增加了Fc-FGF 21浓度，这抑制了小鼠的体重增加。此外，在高剂量下，AAV 8-Fc-FGF 21小鼠的肝脏重量低于AAV 8-FGF 21小鼠的肝脏重量（图1A和1B）。2（k）-（m）和图S4（b）-（d））。总之，AAV 8-Fc-FGF 21处理在增加血清浓度和降低体重和肝脏重量方面比AAV 8-FGF 21更有利。H. Wu，D.胡角Li等人工程21（2023）203207图1.一、AAV 8介导的抗HIV-1双功能蛋白的基因递送（a）表示两种抗HIV-1双功能蛋白BsAb（n118-mD1.22）和BsAb-sFc（n118-sFc-mD 1.22）的设计的图（b）通过Octet-Red 96装置测量BsAb-sFc和BsAb对gp 140的结合亲和力（c）BsAb和BsAb-sFc的药代动力学(d)通过监测Jurkat T-CD 16 a细胞在与BsAb-sFc和BsAb孵育后的荧光素酶活性来测量ADCC活性。(e)BsAb和BsAb-sFc对一组19种HIV-1假病毒亚型的中和滴度。(f)表示动物研究中使用的AAV8载体和实验设计的图。(g)代表AAV 8-RFP（红色）感染的Huh 7和HepG 2细胞的图像还进行了DAPI染色（蓝色）。呈现了双重染色的合并图像（h）在每只小鼠施用（h）1× 1011、（i）1× 1012和（j）1× 1013个载体基因组（vg）的动物中，AAV 8-BsAb和AAV 8-BsAb-sFc的表达 对照小鼠也接受相同的AAV 8-RFP。 所有值均表示为平均值土SEM。NK：自然杀伤细胞;RLU：相对光单位;RFP：红色荧光蛋白;DAPI：4，0，6-二脒基-2-苯基吲哚;ITR：反向末端重复序列;KD：解离常数; Poly（A）：聚腺苷酸;G4 S：甘氨酸-丝氨酸（GGGGS）接头。* 表示p <0.001。H. Wu，D.胡角Li等人工程21（2023）203208×图二. AAV 8-FGF 21和AAV 8-Fc-FGF 21的体内表达。(a)表示AAV8载体和实验设计的图。(b)-（e）-（h）-（（k）-BALB/c小鼠给予（b，e，h，k）1× 1010、（c，f，i，l）1×1011和（d，g，j，m）1× 1012 vg/小鼠的AAV 8-FGF 21或AAV 8-Fc-FGF 21。对照小鼠也接受相同的AAV 8-RFP。所有值均表示为平均值土SEM。NS：无显著性。** 代表p0.01; * 代表p0.001。3.4. 比较不同AAV8递送的FGF 21剂量对骨和脂肪基于这些结果，AAV 8-Fc-FGF 21小鼠显示体重显著降低。使用小鼠的CT图像分析脂肪脂肪组织体积无明显减少，在低（图）附录A中的S5（a）和（b））和中剂量组（图附录A中S5（c）和（d））。相比之下，在高剂量组中，AAV 8-Fc-FGF 21组中的内脏脂肪体积低于AAV 8-FGF 21组中的内脏脂肪体积（图1A和1B）。附录A中S5（e）和（f））。综上所述，AAV 8-Fc-FGF21组内脏脂肪体积的减少大于AAV 8-FGF 21组，这进一步证实了延长FGF 21的半衰期可以增加其在体内的浓度并减少脂肪组织体积。为了检查慢性FGF 21或Fc-FGF 21暴露对骨的影响，进行胫骨的CT扫描。我们的研究结果表明，在低-AAV 8-FGF 21-和AAV 8-Fc-FGF 21-处理的小鼠在中等剂量组中均显示出某些骨参数如骨体积（BV）和BV/组织体积（TV）的降低（附录A中的图S6），而小鼠还显示出发展骨质疏松症的风险，如由减少的骨小梁数目（Tb.N）和增加的骨小梁分离（Tb.Sp）所指示的（图S6）。附录A中的S7）。此外，与AAV 8-FGF 21处理的小鼠相比，AAV 8-Fc-FGF 21处理的小鼠在高剂量组中显示出更严重的骨丢失，例如更低的骨表面（BS）和TV（附录A中的图S8总之，慢性FGF 21或Fc-FGF 21暴露导致骨量损失，特别是在骨小梁中。当Fc-FGF 21浓度持续高至1300 ng·mL-1时，骨丢失比FGF 21更严重（图11）。 2（g）和图。S8）。3.5. Fc-FGF 21过量表达改善db/db小鼠的为了评价对肥胖症的治疗效果，将Fc-FGF 21或FGF 21以每只小鼠1× 1011vg单次注射给药至瘦素受体缺陷型db/db小鼠的遗传模型[29]，其是T2 DM的非胰岛素依赖性糖尿病模型，其显示出高血糖、胰岛素抵抗和肥胖症的特征[30]。结果显示，与初始体重相比，Fc-FGF 21组小鼠（命名为KO-Fc-FGF 21）的体重增加了1.8%，低于FGF 21组的13.8%（命名为KO-FGF 21;附录A中的图3（a）和图S9）。值得注意的是，瘦素受体似乎是FGF 21对体重的影响所必需的，因为所有治疗组在db/db小鼠中显示出很少的体重减轻[31]。KO-Fc-FGF 21组的血糖水平在治疗6周后恢复正常，并且优于KO-FGF 21组（图1B）。3（b））。类似地，ITT和GTT结果显示KO-Fc-FGF 21组中胰岛素敏感性和葡萄糖耐量的更有效改善（图1A和1B）。3（c）和（d））。综上所述，这些结果表明Fc-FGF 21在db/db小鼠模型中具有更好的治疗效果。此外，通过比较小鼠血清中FGF 21和Fc-FGF 21的浓度，我们发现Fc-FGF 21的浓度显著高于FGF 21的浓度（图3（e））。然而，两组之间的mRNA水平没有明显差异（图11）。3（f））。因此，可以合理地推测，增加的Fc-FGF 21浓度是半衰期延长的结果此外，这些结果显示Fc-FGF 21改善db/db小鼠中的葡萄糖调节和胰岛素敏感性H. Wu，D.胡角Li等人工程21（2023）203209图三.在db/db小鼠模型中的AAV 8递送的基因疗法。在不同时间测量不同组小鼠的（a）体重和（b）血糖。对照组包括注射AAV 8-RFP的野生型小鼠（n= 6）和db/db小鼠（n=6），并且实验组中的其它db/db小鼠注射AAV 8-FGF 21（n= 6）或AAV 8-Fc-FGF 21（n= 6）。所有小鼠均接种1× 1011 vg/只病毒。（c）腹腔注射葡萄糖（1g·kg-1体重）后测定GTT（d）腹腔注射胰岛素（2U·kg-1体重）后进行ITT（e）施用AAV8载体后不同时间点的FGF21血清水平（f）通过RT-qPCR测量用AAV 8-FGF 21或AAV 8-Fc-FGF 21处理的小鼠器官中的mRNA水平（相对mRNA水平）。（g）碱性磷酸酶（ALP）、天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）的血清水平（h）肝脏TC和TG水平。（i）不同脂肪组织的定量。（j）皮下（黄色）、内脏（绿色）和棕色脂肪（红色）分布以及胫骨骨小梁的CT 3D图像。（k，l）（k）小梁的定量（1）骨密度（BMD）。所有值均表示为平均值土SEM。* 表示p0.05;** 表示p0.01;* 表示p0.001。H. Wu，D.胡角Li等人工程21（2023）2032103.6. Fc-FGF 21减轻db/db小鼠肥胖是脂质异常的重要原因，因此，测量KO-Fc-FGF 21和KO-FGF21组中的脂质水平。大多数脂质指标没有明显改善，然而，Fc-FGF 21通过降低甘油三酯（TRIG）和低密度脂蛋白CHOL（LDL;图1B）的浓度显著减轻血脂异常。附录A中的S10）。此外，使用血清标志物评估肝功能，其显示除天冬氨酸氨基转移酶（AST）外，KO-Fc-FGF 21组中丙氨酸氨基转移酶（ALT）和碱性磷酸酶（ALP）的血清水平较低，表明KO-Fc-FGF 21可改善肝功能（图3（g））。在KO-Fc-FGF 21组中，肝脏TC和TG水平没有显著降低（图3（h）），然而，肝脏重量低于KO-FGF 21组（图3（h））。附录A中S11（a）和（b））。HE的组织学分析也表明KO-Fc-FGF 21在减少肝脏脂质蓄积方面具有更好的治疗效果（附录A中的图S11Fc-FGF 21在改善血脂异常、降低血清LDL和TRIG浓度、升高高密度脂蛋白CHOL（HDL）和减少肝脏脂质蓄积方面的疗效优于FGF 21。3.7. Fc-FGF 21处理增强db/db小鼠中的能量消耗FGF21增加能量消耗并降低体重[32]。在db/db小鼠的喂养期间，KO-Fc-FGF 21组中的烦渴和多尿症状得到改善。虽然KO-Fc-FGF 21组中体重没有减少，但体重增加受到抑制。我们假设小鼠体重增加减少是由于Fc-FGF 21抑制脂肪合成和增强碳水化合物代谢。因此，使用代谢笼实验检查各组的代谢指标。结果显示，在K 0-FGF 21-和K 0-Fc-FGF 21-处理的小鼠中观察到O2消耗和CO2产生的显著降低，并且接近正常小鼠的水平（图1A和1B）。附录A中S12（a）和（b））。值得注意的是，在KO-Fc-FGF 21组中，呼吸交换率（RER）也从肥胖引起的失调调节向正常水平转变，并且KO-Fc-FGF 21治疗的小鼠没有显示出产热和运动距离的增加，强烈表明观察到的体重增加的抑制是由于KO-Fc-FGF 21治疗的小鼠的体重增加的增加。代谢变化（图附录A中S12（c）、（d）和（e））。这些结果表明，Fc-FGF 21改善db/db小鼠能量代谢的作用主要是通过增加碳水化合物代谢和抑制脂肪持续合成来实现的，其效果优于FGF 21。3.8. Fc-FGF 21治疗不会减少db/db小鼠的脂肪体积，也不会导致骨质流失，但会加重白色脂肪组织（WAT）根据结果，高Fc-FGF 21和FGF 21浓度促进WT小鼠的体重减轻和脂肪降解然而，在db/db小鼠中存在最小的体重减轻。因此，我们使用CT扫描检查脂肪体积脂肪的定量显示，FGF 21和Fc-FGF 21都没有有效地减少皮下脂肪（黄色）、内脏脂肪（绿色）和棕色脂肪（红色）的体积; 3（i）和（j））。此外，HE&染色显示WAT体积没有减少，棕色脂肪组织的脂质脂解没有改善（BAT;图1A和1B）。附录A中S13（a）和（b））。由于肥胖可引起WAT中的炎症，因此用F4/80标记巨噬细胞，并通过免疫染色分析巨噬细胞浸润。结果显示，KO-Fc-FGF 21组的WAT中浸润的巨噬细胞小于KO-FGF 21组，表明KO-Fc-FGF 21组中WAT中的炎症被显著抑制（图1A和1B）。附录A中S13（c）和（d））。结果显示，高浓度的Fc-FGF 21和FGF 21诱导WT小鼠的骨丢失，并且使用CT扫描分析小鼠的 Tb.N显著高于（图3（k）），Tb.Sp较低，小梁厚度（Tb.Th）与WT对照组小鼠相比，在所有db/db小鼠中均显示出增加的趋势（图1A和1B）。附录A中S14（a）和（b））。此外，用于评估骨量的参数包括骨矿物质密度（BMD）、BS/BV降低，而其他参数包括BS、BV、BS/TV和BV/TV也显著增加（图3（l）和图3（l））。附录A第S14（c）-（h）段）。此外，与KO-RFP对照组小鼠相比，KO-FGF 21和KO-Fc-FGF 21处理的小鼠中我们推测，db/db小鼠的较大尺寸可能也导致了骨体积的增加，这导致了骨参数的增加。上述结果表明，在db/db小鼠模型中，Fc-FGF 21和FGF 21都没有减少小鼠的脂肪体积，也没有引起副作用，如骨小梁和骨量减少。3.9. Fc-FGF 21在DIO小鼠模型中减轻体重并改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐量上述结果表明，尽管实现了高浓度的Fc-FGF 21，但在db/db小鼠模型中治疗效果不足。众所周知，长期喂食高脂饮食（HFD）的小鼠会发生T2DM，伴随体重增加、WAT和胰岛素抵抗[33]。因此，在DIO小鼠模型中探索了AAV 8递送的FGF 21或Fc-FGF 21的治疗效果使用与db/db小鼠所述相同的给药方法，用Fc-FGF 21处理的动物（命名为HFD-Fc-FGF 21）体重减轻45.9%，高于FGF 21处理组体重减轻27.1%（命名为HFD-FGF 21;附录A中图4（a）和图S15）。此外，胰岛素敏感性和分解代谢能力HFD-Fc-FGF 21组的葡萄糖浓度也优于HFD-Fc-FGF 21组。HFD-FGF 21组（图1A和1B）。4（b）-（d））。总之，FGF 21的半衰