没有合适的资源?快使用搜索试试~ 我知道了~
© 2013年。由爱思唯尔公司出版信息工程研究院负责评选和同行评议可在www.sciencedirect.com上在线获取ScienceDirectIERI Procedia 5(2013)258 - 2642013年农业与自然资源工程马来西亚雪拉扬温泉产脂嗜热菌的生化特性及16S rDNA序列分析M.J. Norashirenea,H.,Umi Saraha,M.H,Siti Khairiyaha和S.,努尔迪亚娜aa马来西亚雪兰莪州沙阿南40450马拉科技大学应用科学学院摘要嗜热菌是众所周知的可以承受极端温度的生物。来自嗜热菌的热酶由于其耐受极端pH和高温的整体稳定性而具有许多生物技术应用的潜力。由于脂肪酶在工业上的重要性,人们一直对分离产生脂肪酶的新细菌菌株感兴趣。从马 来 西 亚 Selayang 温 泉 中 分 离 到 6 株 产 脂 肪 酶 的 嗜 热 菌 , 即 K7S1T53D5 、 K7S1T53D6 、 K7S1T53D11 、K7S1T53D12、K7S2T51D14和K7S2T51D19。采样点的pH值为中性,记录的最高温度为53°C。为了筛选和分离脂肪分解热电堆,使用含有吐温80的选择性培养基。通过在53°C下孵育阳性分离株,证明并确定了热稳定性和即使在较高温度下降解底物的能力。获得了具有圆形边界、凸起且边缘完整且不透明的菌落。16S rDNA基因扩增和序列分析用于细菌鉴定。K7S1T53D6菌株来源于芽孢杆菌属,芽孢形成型,杆状,需氧,具有降解油脂的能力。同时,分离物K7S1T53D5、K7S1T53D11、K7S1T53D12、K7S2T51D14和K71S2T51D19来自短芽孢杆菌属。这些分离物能够产生脂肪酶。通过NCBI BLASTn进行的序列比对显示,分离物K7S1T53D6与Sonorensis芽孢杆菌具有最高的相似性,得分为97%。其中K7S1T53D5、K7S1T53D11、K7S1T53D12、K7S2T51D14和K7S2T51D19与Borstelensis的相似性最高,达到98%。结果表明,该菌株来源于短芽孢杆菌属和芽孢杆菌属,序列同源性为93%~98%。© 2013作者。由爱思唯尔公司出版 在CC BY-NC-ND许可下开放访问。信息工程研究院负责评选和同行评议关键词:嗜热菌,嗜热酶,脂肪酶,16S rDNA基因,温泉2212-6678 © 2013作者由爱思唯尔公司出版 在CC BY-NC-ND许可下开放访问。信息工程研究所负责的选择和同行评审doi:10.1016/j.ieri.2013.11.101M. J. Norashirene等人/ IERI Procedia 5(2013)2582591. 介绍由于其广泛的生物适应性和许多工业应用,嗜热菌被认为是最重要的微生物之一。嗜热菌能够在高温下生长和繁殖,并产生具有独特和有价值特性的胞外酶,这是由于它们能够操纵其遗传组成。因此,这些微生物被认为是工业和生物技术应用中最有价值的生物勘探微生物。嗜热菌产生的热稳定酶具有独特的性质,如在有机溶剂和洗涤剂中的高稳定性[1]。脂肪酶或也称为甘油三酯脂肪酶是水溶性酶,其催化甘油三酯中酯键的水解,将其降解为甘油和脂肪酸。它构成了被广泛利用的最重要的次级代谢物组[2]。脂肪酶可以从动物、植物和微生物如嗜温细菌、酵母和真菌中分离。微生物生产脂肪酶是商业上重要的,因为它们的通用特性和它们与其他天然来源相比广泛的胞外生产[3]。与它们的嗜中温对应物相比,来自嗜热菌的脂肪酶在极端pH和温度下的抗性和高反应速率方面更优越[4]。它具有独特的特性,如广泛的底物特异性,区域特异性,位置选择性,不需要辅因子,立体选择性和在有机溶剂,极端pH和温度下相当稳定和活性[5]。2. 材料和方法2.1 野外采样采集了色拉洋温泉的环境热水样品,记录了当时的温度和pH值。将水样接种于增菌肉汤培养基A中以增菌培养物悬液,然后进一步培养至增菌琼脂培养基A。将培养基在53 ℃下孵育48小时,以确保一般嗜热菌的繁殖。在高于50 ºC的温度下孵育将消除嗜温细菌污染的风险。将在平板A上观察到的任何菌落生长进一步接种到选择性培养基B上,用于筛选能够利用脂质作为其底物的嗜热菌。2.2 脂解活性为了富集嗜热菌,制备由氯化钠(1%)、细菌酵母提取物(1%)、蛋白胨(2%)和琼脂(2%)组成的培养基A,并根据采样部位的pH值进行调节[6]。使用含有脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)的培养基B作为筛选培养基,以检测产脂肪酶的嗜热菌。脂解活性可以通过菌落周围透明区的水解来检测。根据Fariha等人(2006),在中性pH下制备所用筛选培养基(由蛋白胨(10)、氯化钠(5)、CaCl 2.2H20(0.1)和琼脂(20)组成(g/l),并进行微小修改[6]。在灭菌过程(121 ℃,15 min)后,将浓度为1%的吐温80单独加入培养基中。2.3. 常规生化试验方法对所有表现出脂解活性的菌株进行以下生化试验:氧化酶、淀粉水解、V-P反应、过氧化氢酶、尿素酶、柠檬酸盐、碳水化合物利用、吲哚产生和甲基红试验。所有生化试验均按照标准进行,260M. J. Norashirene等人/ IERI Procedia 5(2013)258生化图表[7]。2.4. 形态表征所有在筛选培养基上显示出阳性脂解活性的分离株均根据显微镜外观和培养特征进行进一步表征。用显微镜观察分离菌株的形态,推断其对革兰氏染色、孢子染色和抗酸染色试验的反应。在53 ℃下在选择性培养基上培养48小时后,还对菌落特征进行了基于形状、大小、高度和不透明度的评价。此外,还制备了运动琼脂穿刺,以确定所选细菌分离株中鞭毛的存在[8]。2.5. 16S rDNA基因使用QiagenDNeasy ® DNA提取试剂盒进行细菌基因组提取,然后使用两种通用引物进行16 S rDNA扩增:63 F(5 '-CAGGCCTAACACATGCAAGTC -3')和1389 R(5' -ACGGGCGGTGTACAAG-3')。使用FIREPol DNA聚合酶核心试剂盒(Solis BioDyne),按照如下标准三步方案进行聚合酶链反应:94 °C变性1分钟,60 °C引物退火30秒,在72 °C延伸30秒,加上在72°C最终延伸10分钟,以建立产物的完全延伸。在观察PCR产物并获得预期条带后,使用OMEGA Bio-Tek Cycle Pure E.Z.N. A Kit纯化产物,以在测序过程之前清除样品中的蛋白质和污染物。2.6测序和计算机模拟分析将扩增的16S rDNA基因产物送至私人实验室First BASE Laboratories Sdn Bhd进行测序。通过NCBIBasic Local Alignment Search Tools、核苷酸(BLASTn)程序以及来自核糖体数据库计划的生物信息学工具; SEQ MATCH和RDP Classifier,将获得的16 S rDNA基因序列与GenBank中的16 S rDNA序列集合进行比对和比较。RDP分类器将提供从域到属的分类分配。另一方面,SEQ MATCH将提供额外的数据,特别是基于序列比对提供最高百分比的同源性。一旦检测到物种的密切相关性,就可以使用多序列比对来确定物种。还根据Bergey手册中概述的生理学和显微镜特征与脂解分离株的生化和形态学特征汇编数据之间的比较进行了初步细菌鉴定3. 结果和讨论3.1 解脂嗜热菌考虑到如果微生物被允许在含有脂质或吐温80作为唯一碳源的培养基中生长,那么它应该产生脂肪酶以利用脂质用于其生长和代谢需要。由于脂肪酶是不溶性物质,选择性培养基含有吐温80作为唯一的脂质底物。Twen 80已被证明是一种优良的脂质类似物,并在许多与脂肪酶相关的实验中被广泛用作 可 靠 的 底 物 。 它 是 脂 质 的 无 定 形 和 酯 化 形 式 。 本 研 究 共 分 离 到 6 株 细 菌 ( K7S1T53D5 、K7S1T53D6、K7S1T53D11、K7S1T53D12、K7S2T51D14和K7S2T51D19)。脂解分离株为M. J. Norashirene等人/ IERI Procedia 5(2013)258261根据菌落周围水解区的形成进行选择。Espinosa等人(1990)[9]和Fariha等人(2006)[6]报告称,吐温80通过增加细胞渗透性诱导脂肪酶合成,还促进某些化合物通过细胞膜输出细胞,以提高微生物底物的可用性。3.2 形态特征学根据大小、形状、高度、边缘、颜色、质地和不透明度,进一步评价和分类经证明显示阳性脂质水解活性的所选细菌分离株。在显微镜下观察显示,这些脂解分离株产生的菌落较大,具有圆形边界,凸起,具有整个边缘,并且相对于不透明性被鉴定为不透明。抗酸和内生孢子染色结果表明,这些菌株均为非抗酸型,不具有产生内生孢子的能力。6株产脂肪酶的阳性菌株均为革兰氏阳性菌,无鞭毛,杆状。3.3 生化试验表1.0显示了所有阳性脂解分离株的生化反应,表示为K7S1T53D5、K7S1T53D6、K7S1T53D11、K7S1T53D12、K7S2T51D14和K7S2T51D19。根据下表1.0所有的分离株仅对单一的生物化学试验呈阳性反应,该试验是过氧化氢酶试验。在分离株D5和D19上观察到例外情况,其在柠檬酸盐利用试验中显示阳性反应。对于其他试验,所有细菌分离株均显示阴性反应。表1.0解脂嗜热菌生化试验D5D6D11D12D14D19氧化酶------淀粉水解------V-P反应------氢酶++++++脲酶------柠檬酸+----+碳水化合物利用------吲哚产生------甲基红------图例:阳性(+);阴性(-)3.4 16S核糖体DNA基因262M. J. Norashirene等人/ IERI Procedia 5(2013)258使用分析软件RDP Classifier分析获得的16S rDNA基因序列,以将其分配到各自的细菌发生和细菌分类中[10]。结果表明,所有菌株均属于厚壁菌门、芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目和类芽孢杆菌科细菌属,其中K7S1T53D6属于芽孢杆菌属,而K7S1T53D5、K7S1T53D11、K7S1T53D12、K7S2T51D14和K7S2T51D19属于短芽孢杆菌属。这些结果与BLASTn结果相关联,BLASTn结果将分离株的16S rDNA序列与具有97%同一性的芽孢杆菌属和落在96%至98%同一性的各种范围内的短芽孢杆菌属特异性在由Bisht和Panda(2011)[12]在印度Taptapani温泉进行的研究中,他们报告了从具有相似特征的短芽孢杆菌属中成功分离的细菌分离物;耐热的,具有产生各种类型的脂解酶的能力,包括羧酸酯酶,一种属于丝氨酸水解酶类的具有水解羧酸酯的能力的酶,真正的脂肪酶,其对四种主要类型的磷脂酶和水不溶性长链甘油三酯表现出最大活性。在此基础上,对K7 S1 T53 D5、K7 S1 T53 D11、K7 S1 T53D12、K7 S2 T51 D14和K7 S2 T51 D19进行了短芽孢杆菌(Brevibacillus)的鉴定,结果表明它们的相似 性 在 96%~ 98% 之 间 , 推 测 为 产 脂 肪 酶 的 嗜 热 菌 。 具 体 地 说 , 细 菌 分 离 物 显 示 出 与Brevibacillusborstelensis菌株和Brevibacilluspanacihumi具有非常高百分比的同源性。在形态特征和发现它的栖息地的比较中,它们具有非常相似的特征;杆状,平坦光滑的菌落在营养琼脂上形成,能够在pH 7和温度53 °C下生长。对芽孢杆菌属的16S rDNA序列进行系统发育分析表明,这些嗜热嗜碱芽孢杆菌在种水平上形成了一个遗传上一致的类群,并与芽孢杆菌属的B. sonorensis,B. aerius和B. subtilis是它们的近亲。该结果可以在K7S1T53D6的细菌分离物中看到,因为分离物显示出与那些物种非常高的相似性百分比。分离物与3种芽孢杆菌的二元序列相似性在94- 97%之间。认为这些值足够高,可以保证将分离株置于芽孢杆菌属的不同种属中。Fairolniza等人进行的研究,(2011)[13]还表明,从霹雳州温泉中分离的细菌是嗜热细菌,其与芽孢杆菌的同源性最高值为99%。细菌的特征是好氧细菌,其为革兰氏阳性、杆状、不动,能够在40°C至80°C的高温下生长,最佳生长温度为70 °C。这种特殊的芽孢杆菌。与K7S1T53D6菌株相比,K7S1T53D6菌株具有相同的特性,也能在相同温度和pH值的选择性培养基上生长和繁殖,因此可以推断K7S1T53D6菌株是一株产脂肪酶的嗜热菌。表2.利用BLASTn嗜热菌序列号a(%)同一性b最接近的系统发生相对物(GenBank登录号)分离株K7S1T53D5138298波斯特短芽孢杆菌菌株DSM 6347(NR_040984.1)95博尔斯泰短芽孢杆菌菌株Logan B4029(NR_029131.1)K7S1T53D6117097Sonorensis芽孢杆菌菌株NRRL B-23154(NR_0251301)94空气芽孢杆菌菌株:24K(NR_042338.1)94枯草芽孢杆菌菌株DSM 10(NR_027552.1)M. J. Norashirene等人/ IERI Procedia 5(2013)258263K7S1T53D11152297波斯特短芽孢杆菌菌株DSM 6347(NR_040984.1)97博尔斯泰短芽孢杆菌菌株Logan B4029(NR_029131.1)95Panacihumi短芽孢杆菌菌株DCY35(NR_044485.1)K7S1T53D12151296波斯特短芽孢杆菌菌株DSM 6347(NR_040984.1)96博尔斯泰短芽孢杆菌菌株Logan B4029(NR_029131.1)K7S2T51D14137296波斯特短芽孢杆菌菌株DSM 6347(NR_040984.1)96博尔斯泰短芽孢杆菌菌株Logan B4029(NR_029131.1)94Panacihumi短芽孢杆菌菌株DCY35(NR_044485.1)K7S2T51D19133297博尔斯泰短芽孢杆菌菌株Logan B4029(NR_029131.1)96Panacihumi短芽孢杆菌菌株DCY35(NR_044485.1)a用于比对的16S rDNA核苷酸的数量b与嗜热菌最接近的系统发育相对物的同一性4. 结论上述研究清楚地鉴定并分类了从色拉洋温泉分离的细菌为具有产生脂肪酶能力的嗜热嗜热菌。像这样的研究是从这个独特的生态系统中挖掘微生物生物技术潜力的先决条件。16S rDNA分析表明,这些菌株分别来自短芽孢杆菌属和芽孢杆菌属。所有分离的脂解嗜热菌都具有降解其底物的能力,即使在高于50 ℃的高温下。16S rDNA基因的全序列测定和16S rDNA限制性内切酶图谱分析可用于分离株的鉴别和分类。为了推断这些细菌分离物的脂解活性的最大速率,推荐酶测定。确认该项目由研究密集基金(RIF)资助,Universiti Teknologi MARA(RIF)[600- RMI/ST/DANA5/3/RIF(228/2012)]引用[1] Elnasser,Z.,Maraqa,A.,Owais,W.,和Khraisat,A.约旦新嗜热菌的分离和鉴定。微生物学网络杂志,2007;3(2):201-227[2] Heravi,K.M.,Eftekhar,F.,亚赫恰利湾和Fatemeh,T.土壤中一株产脂肪酶芽孢杆菌的分离与鉴定。Pakistan Journal of Biological Science,2008;11(5):740 - 745.[3] 夏尔马河,巴西-地Chisti,Y.和Banerjee,U. C.脂肪酶的生产、纯化、表征和应用。生物技术进展,2001;19(8):627-662[4] Demirjian,D.,Moris Varas,F.和卡西迪,C. S.极端微生物的酶。化学生物学新论,2001;5:144-151.[5] Royter,M.,施密特,M.,埃伦德角,Hobenreich,H.,Schafer,T.,北卡罗来纳州博恩朔尔和Antranikian,G.从极端嗜热厌氧细菌Thermoanaerobium thermohydrosulfuriicus SOL 1和Caldanaerobium subacrieus subsp. 腾冲极端微生物,2009;13:769-783。264M. J. Norashirene等人/ IERI Procedia 5(2013)258[6] Fariha,H.,Aemer,A.S.和Abdul,H.培养条件对芽孢杆菌FH 5产脂肪酶的影响。微生物学年鉴,2006;56(3):247-252.[7] 乔治,M.G.,Julia,A.B. Timothy,G.L.原核生物分类学概要。Bergey's Manual of TaxonomicBacteriology.第二版,纽约州斯普林格出版社.100- 103页; 2004年。[8] 卡布奇诺,J.G.和Sherman,N.(2005年)。微生物学实验手册.第7版,Pearson Education,Inc.,旧金山143-189页; 2005年。[9] Espinosa,E.,Sanchez,S.和Farres,A.影响德氏根霉CDBB H313产脂肪酶的营养因素生物技术,1990;12:209-214.[10] 王建奎,Garrity,GM,J. M.蒂杰和科尔,J.R.用于快速将rRNA序列分配到新细菌分类中的朴素baidu分类器。应用环境微生物学,2007;73(16):5261-5267.[11] 张志,施瓦茨,S.,瓦格纳湖,Miller,W.一个贪婪的DNA序列比对算法。Journal ComputBiol,2000;7:203-14.[12] Bisht,S.S.熊猫,A.K.印度奥里萨邦Taptapani温泉中几株产脂肪酶嗜热菌的生化特性和16SrRNA序列分析生物技术研究国际,2011;1:1[13] Fairolniza,M.S.,Raja Noor Zaliha,R.A.R.,马希兰湾和Abu Bakar,S.一种新的芽孢杆菌耐热脂肪酶。International Journal of Molecular Science,2011;12:2917-2934.
下载后可阅读完整内容,剩余1页未读,立即下载
cpongm
- 粉丝: 4
- 资源: 2万+
上传资源 快速赚钱
- 我的内容管理 收起
- 我的资源 快来上传第一个资源
- 我的收益 登录查看自己的收益
- 我的积分 登录查看自己的积分
- 我的C币 登录后查看C币余额
- 我的收藏
- 我的下载
- 下载帮助
会员权益专享
最新资源
- zigbee-cluster-library-specification
- JSBSim Reference Manual
- c++校园超市商品信息管理系统课程设计说明书(含源代码) (2).pdf
- 建筑供配电系统相关课件.pptx
- 企业管理规章制度及管理模式.doc
- vb打开摄像头.doc
- 云计算-可信计算中认证协议改进方案.pdf
- [详细完整版]单片机编程4.ppt
- c语言常用算法.pdf
- c++经典程序代码大全.pdf
- 单片机数字时钟资料.doc
- 11项目管理前沿1.0.pptx
- 基于ssm的“魅力”繁峙宣传网站的设计与实现论文.doc
- 智慧交通综合解决方案.pptx
- 建筑防潮设计-PowerPointPresentati.pptx
- SPC统计过程控制程序.pptx
资源上传下载、课程学习等过程中有任何疑问或建议,欢迎提出宝贵意见哦~我们会及时处理!
点击此处反馈
安全验证
文档复制为VIP权益,开通VIP直接复制
信息提交成功