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工程3(2017)16研究组织工程膝骨关节炎治疗的再生工程:生物材料和细胞技术Jorge L.Escobar Iviricoa,b,c,#,Maumita Bhattacharjeea,b,c,#,Emmanuel Kuyinua,b,c,Lakshmi S.奈尔a,b,c,d,e,f加图Laurencina,b,c,d,e,f,g,h,*a再生工程研究所,康涅狄格大学健康中心,Farmington,CT 06030,USAb雷蒙德和贝弗利萨克勒生物医学、生物、物理和工程科学中心,康涅狄格大学健康中心,法明顿,CT 06030,USAc美国康涅狄格州法明顿康涅狄格大学健康中心矫形外科,邮编:06030d美国康涅狄格大学工程学院生物医学工程系,Storrs,CT 06269e美国康涅狄格大学工程学院材料科学与工程系,Storrs,CT 06269,USAf康涅狄格大学材料科学研究所,Storrs,CT 06269,USAg美国康涅狄格大学健康中心牙科学院颅面科学系,Farmington,CT 06030h康涅狄格大学工程学院化学与生物分子工程系,Storrs,CT 06269,USAARt i clEINf oA b s tRAC t文章历史记录:2016年10月31日收到2016年12月28日修订2016年12月30日接受2017年2月14日在线提供保留字:间充质干细胞生物材料再生工程膝关节骨关节炎(OA)是全球最常见的关节炎形式。这种疾病的发病率正在上升,治疗造成了经济负担。膝关节OA治疗的两个早期目标包括疼痛的主要症状和膝关节中的软骨损伤。目前的治疗方法在治疗这种疾病方面是有益的,但没有一种方法像全膝关节置换术(TKA)那样有效。然而,虽然TKA是疾病的终末期解决方案,但它是一种侵入性和昂贵的手术。因此,应制定创新的再生工程策略,因为这些策略可能会推迟或取消TKA的需求。目前正在开发几种基于生物材料和细胞的疗法,并在临床前和临床研究中显示出早期的前景。使用先进的生物材料和干细胞单独或联合治疗膝关节OA可能会减少疼痛和再生局灶性关节软骨损伤。在这篇综述中,我们讨论了膝关节OA疼痛和软骨损伤的发病机制,并探讨了目前正在研究的新的治疗方案,以及它们的一些局限性。© 2017 The Bottoms.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版这是CC BY-NC-ND下的开放获取文章许可证(http://creati v ecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。1. 介绍骨关节炎(OA)是一种慢性、使人衰弱和疼痛的疾病,并且是世界上最常见的关节炎形式它是一种复杂的疾病,累及整个滑膜关节,包括关节软骨、滑膜和软骨下骨[1,2]。这种疾病涉及关节中促炎因子的释放,导致结构紊乱(图10)。 ①的人)。重要的是,OA是由于疼痛导致残疾的主要原因;它占了AP-预防70%的关节炎相关住院和23%的关节炎门诊就诊[3]。膝关节骨性关节炎是最常见的骨性关节炎形式,鉴于解剖位置,因为膝关节承受身体的大部分重量。50岁以上的老年人患膝关节OA的风险增加,可能是由于激素变化或软骨细胞衰老[3,4]。据估计,三分之一的美国成年人患有肥胖症,其中三分之二的人在其一生中有患膝关节OA的风险[1,5,6]。这种风险可能是由于关节上的承重增加或* 通讯作者。电子邮件地址:laurencin@uchc.edu#这些作者对这项工作做出了同样的http://dx.doi.org/10.1016/J.ENG.2017.01.0032095-8099/© 2017 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。 这是CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章(http://creati v ecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。可在ScienceDirect工程杂志主页:www.elsevier.com/locate/engJ.L.E. Ivirico et al. / Engineering 3(2017)16-2717Fig. 1. (a)健康关节和(b)OA关节之间的结构变化。基质蛋白酶的表达在OA的发生中起重要作用。(经许可改编,参考文献)[2])脂肪因子是从脂肪组织释放的细胞因子在美国,2008年估计有2700万成年人患有OA,预计到2030年,成人关节炎患者的数量将从2005年的4780万增加到6700万以上[7,8]。然而,通过诸如《平价医疗法案》等医疗计划,寻求医疗帮助的人数预计将进一步增加[9]。每名诊断为膝关节OA的患者每年治疗膝关节OA的总费用超过6000美元,终生费用超过10万美元[10,11]。然而,这一数字仍然不大,因为没有考虑到OA的真正这些额外的成本包括工作时间的损失以及由于疼痛造成的残疾对患者生活质量的影响因此,OA是一个非常重要的健康问题,它给患者带来了身体负担,给患者和医疗保健系统带来了经济负担。膝关节OA的终末期手术解决方案,对于OA治疗的大部分成本,全膝关节置换术(TKA)[3,10,11]。TKA涉及用金属合金和聚合物制成的假体置换膝关节该手术缓解了疼痛,改善了身体功能,并提高了大多数患者的生活然而,对于失败的关节置换术,需要进行翻修手术并不罕见预计到2030年,将需要超过300万例TKA手术,同时翻修手术也将随之增加[13]。这比2005年的450 000例TKA手术有所随着膝关节骨性关节炎的患病率和管理成本的增加,重要的是要为该疾病开发更新的、侵入性更小的、更具成本效益的治疗干预这些治疗也应该推迟或消除对TKA的需求。由于研究人员的不断努力,已经开发出了不同成功率的方法。这种创新的一个非手术性的例子是 软 骨 下 成形 术 。 这 涉 及 使 用 磷 酸 钙骨 替 代 品 治 疗 骨 髓 病变(BML),这与终末期OA的发展有关;因此,该手术可预防严重OA和TKA的需要[14,15]。尽管该手术很有用,但由于患者的可变性,一些患者的情况并不好[14]。此外,使用软骨下成形术是仅限于BML。因此,利用生物材料科学、干细胞科学、发育生物学和物理力方面的最新进展的新型再生工程“再生工程”被定义为先进材料科学、干细胞科学、物理学、发育生物学和临床转化的融合,用于复杂组织和器官系统的再生[16,17]。在这篇综述中,我们讨论了OA疾病的发病机制和目前的生物材料和细胞为基础的技术来治疗膝关节OA。2. 骨关节炎疼痛和治疗方式疼痛是患者出现膝关节OA症状时就诊的首要原因这种疼痛可能在没有同时出现膝关节OA的放射学证据的情况下发生[3,18]。疼痛可能是钝痛和持续性的,伴有间歇性剧烈加重。OA疼痛的病因是复杂的,涉及几个可改变和不可改变的因素。可改变的风险因素包括体重、结构紊乱、生物学过程(如炎症)和社会文化因素[3,19]。不可改变的因素包括患者遗传学。我们将在后续章节中讨论炎症、结构病理学(如关节软骨损伤)和其他因素对疼痛的影响。2.1. 骨关节炎疼痛导致膝关节OA疼痛的生物学机制取决于患者,尚未完全了解。膝关节中存在的软骨细胞和其他细胞类型产生炎症介质和降解酶,导致细胞凋亡。炎症过程由细胞因子如促炎性白细胞介素和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导[20]。这些介质可被存在于滑膜关节中的神经末梢的受体识别。这种有害刺激可激活高阈值离子通道,导致疼痛信号从外周组织传播到中枢神经系统[21]。在骨关节炎关节中产生的细胞因子可作用于支配关节的伤害感受器(有髓鞘的或未髓鞘的)。18J.L.E. Ivirico等人/工程3(2017)16将疼痛信号从外周组织传递到中枢神经系统的感觉神经元)[20]并产生疼痛。尽管OA与疼痛的频繁发生有关,但其真正的机制尚不清楚。进一步理解的疼痛机制可能有助于开发新的治疗策略,管理OA疼痛。2.2. 骨关节炎疼痛的治疗方式由于膝关节疼痛是膝关节OA最严重的衰弱症状,因此研究了几种非药物和药物治疗。由于合并症和药物毒性风险增加,非药物治疗在老年人中尤其重要[22],这可能补充或阻止药物使用。非药物治疗包括机械方法,如物理治疗、休息、手杖、冰敷和减肥 。 美 国 风 湿 病 学 会 ( ACR ) 和 国 际 骨 关 节 炎 研 究 学 会(OARSI)关于膝关节OA管理的指南强烈建议,缓解OA疼痛的最佳方法是通过定期锻炼减肥[22,23]。陆地和水上治疗练习是最主要的非药物疗法。陆上锻炼可暂时减轻疼痛和身体残疾[24]。Cochrane(独立非政府组织)对44项随机对照试验(RCT)(3537例受试者)进行了综述,此外,来自这些研究(44项RCT,3913名参与者)的中等质量证据表明,运动后身体功能立即改善[25]。水上运动对严重行动不便和功能受限的人也有好处。一项有64名参与者的临床试验表明,在18周的50英尺步行测试前后,水上运动比陆上运动更能缓解疼痛[26]。然而,最近对其他RCT的荟萃分析显示,肌肉骨骼疾病患者的疼痛、身体功能和生活质量仅具有中度有益效果,与陆上运动所达到的效果相似[27,28]。低强度的体育锻炼,如太极拳和瑜伽也即将流行起来.对研究太极拳效果的六项RCT进行的系统性综述表明,这种运动可以控制疼痛并改善膝关节OA患者的身体功能[29]。宾夕法尼亚大学医学中心进行了一项为期八周的瑜伽课程的试点研究,该研究显示50岁以上肥胖患者的疼痛和残疾减少[30]。尽管迄今为止报道的研究有限,但瑜伽和太极拳的结果对膝关节骨性关节炎患者来说是令人鼓舞的在药物治疗方面,最常见使用的药物是非甾体抗炎药(NSAID)[31-例如,一项III期临床试验[38]评价了低剂量美洛昔康制剂口服给药的有效性和安全性,每日一次,持续3个月,用于OA相关疼痛患者。与安慰剂相比,接受美洛昔康治疗的患者在第12周报告了显著改善,但报告了严重的不良反应,包括头痛、腹泻、尿路感染和恶心。某些阿片类药物,如他喷他多和曲马多,也被报告可有效治疗中度至重度急性OA膝关节疼痛[39,40]。在III期试验中报告的关于他喷他多的不良反应涉及胃肠道和中央神经系统[39]。关于曲马多,最常见的不良事件是头晕、恶心和便秘[40]。最近,在现实生活中的试验[41]表明,外用NSAID治疗OA的有效性和安全性。在一年的治疗中,局部和口服NSAID对膝关节疼痛的作用相当,局部NSAID的不良反应较少;此外,与口服治疗相比,由于局部NSAID的不良反应而改变药物的患者较少。局部NSAID可能优于口服NSAID,因为其较低的血浆峰浓度导致较低的引起不希望的副作用的倾向。目前治疗中度OA的临床策略是关节内注射抗炎药物。例如,皮质类固醇和扑热息痛注射剂通常用于缓解疼痛[42]。总体而言,已经研究了几种有效的治疗方法来缓解膝关节OA的炎症和疼痛,尽管具有显著的副作用[43-45]。这些导致了对替代治疗的探索,例如用于膝关节OA疼痛缓解的基于生物材料的方法(粘弹性补充)粘滞补充的概念是基于内-关节透明质酸(HA)注射,以恢复滑液中的粘弹性[46,47]。HA或透明质酸是一种天然润滑剂,由滑膜成纤维细胞和B型滑膜细胞分泌到关节中[48];因此,它广泛用于OA治疗。HA也是细胞外基质(ECM)的主要成分HA是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖酰胺组成的重复非硫酸化二糖单元的阴离子和线性多糖,通过交替的β-1,4和β-1,3糖苷键连接天然HA的分子量约为10 6Da,OA可显著降低其在关节液中的浓度(约4 mg·mL如今,有几种类型的食品药品监督管理局(FDA)批准的可注射HA粘度补充产品(表1)[49-最近发表的RCT比较了关节内注射HA与安慰剂或关节内注射皮质类固醇在OA患者中的疗效[58总体而言,8周后,在OA膝关节疼痛或功能改善方面,HA的使用似乎比最后一次注射后的安慰剂或皮质类固醇更有效表1FDA批准的可注射HA粘弹性补充产品[50产品剂量(mg)频率交联凝胶真弗氏菌属20(3剂)每周没有凝胶一号30(1剂)一旦是的海尔甘20(5剂)每周没有莫诺维斯克88(1剂)一旦是的奥特里维斯克30(3每周没有Supartz FX25(5剂)每周没有Synvisc16(3剂)每周是的Synvisc-one48(1剂)一旦是的3. 腕关节损伤及治疗方法3.1. 软骨损伤膝关节OA的特征是关节进行性退化,涉及关节软骨损伤、软骨下骨增厚、骨赘形成和滑膜继发性炎症[62]。关节软骨是一种无血管组织,富含II型胶原蛋白、糖胺聚糖(GAG),如HA和蛋白聚糖如聚集蛋白聚糖。关节软骨分为三个区域,其细胞形态也各不相同J.L.E. Ivirico et al. / Engineering 3(2017)16-2719如在II型胶原蛋白排列中,其在控制机械性能中起重要作用。关节软骨变性开始于关节表面纤维化的发生和基质大分子框架的破坏。胶原原纤维在表面下方开始明显迷失方向,蛋白多糖含量降低,不仅在软骨的浅表区,而且在软骨的中间区[63]。随着疾病的进展,纤维化延伸到更深层,到达软骨下骨;逐渐地,纤维化的软骨开始在其浅表尖端撕裂。聚集蛋白聚糖在其核心蛋白被截短的情况下发生快速而广泛的降解核心蛋白被切割成片段,其中一些片段保持与HA结合并保留在组织内,而其他片段扩散到滑液中。这种扩散导致聚集蛋白聚糖中存在的净阴离子电荷减少,从而导致其抵抗压缩应力的能力丧失,使组织易于侵蚀。此外,发现聚集蛋白聚糖裂解在个体之间变化,并且在更接近软骨侵蚀的区域中最高[64,65]。随着聚集蛋白聚糖含量的减少,胶原蛋白的组成从II型变为I型[66]。这种变化极大地影响了组织的机械稳定性,因为II型胶原蛋白含有更高含量的羟赖氨酸以及葡萄糖基和半乳糖基残基,促进了其与蛋白聚糖的相互作用[67]。基质变性是由不平衡的金属蛋白酶产生介导的,包括基质金属蛋白酶(MMP)和聚集蛋白聚糖酶,已知其可消化软骨基质[68]。主要的MMP包括基质分解素-1(MMP 3)和胶原酶-3(MMP 13),它们通过蛋白水解去除其前肽而被激活;然后它们在其短的球间结构域和富含硫酸软骨素(CS)的结构域(CS 1和CS 2)切割聚集蛋白聚糖[64]。此外,聚集蛋白聚糖酶家族包括具有血小板反应蛋白基序-4(ADAMTS 4)和ADAMTS 5的去整合素和金属蛋白酶[69],其是以与MMP类似的方式切割聚集蛋白聚糖核心蛋白的有效降解酶。此外,胶原酶已被证明可以消化胶原纤维网,导致蛋白多糖含量降低。软骨基质的结构和组成的这种改变导致关节面的纤维化,从而降低组织的机械强度[70]。ECM变化由许多因素引起,其中之一是由机械损伤或组织磨损引发的炎症。软骨组织中存在的软骨细胞通过参与分解代谢活动对炎症做出反应,最终导致ECM降解[71]。导致分解代谢的各种因素OA中的过程包括TNF-α、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-12、IL-15,和各种相关趋化因子;这些显著增加基质降解蛋白的表达,包括软骨细胞中的MMP和ADAMTS[72]。基质破坏(由于蛋白聚糖PG损失)导致表面孔隙率和渗透性增加,导致组织间质液流出增加。这反过来又导致组织降解和其功能特性的完全丧失因此,了解软骨退化机制可能有助于开发新的潜在治疗策略来修复受损的软骨组织。3.2. 软骨损伤的治疗方式软骨修复的治疗方式包括非手术和手术方法。第2.2节中讨论的非手术方法可用于缓解OA的早期症状;然而,没有证据证明天然组织的解剖结构恢复和病变愈合[73]。手术方法旨在恢复结构和功能特性,从而修复受损的软骨组织。这些方法包括关节镜检查、软骨下钻孔、磨损关节成形术和微骨折术,其集中于使用来自软骨下骨的间充质干细胞(MSC)用于软骨再生。这些方法的主要局限性包括纤维软骨的形成,其吸收冲击的能力较低,因此损害了天然软骨组织的功能特性其他方法包括镶嵌成形术和自体软骨细胞移植,其中自体组织或细胞被收获并用于修复软骨缺损。自体软骨细胞植入(ACI)是一种常用的治疗方法,可能会导致修复部位出现更大比例的透明样组织[74,75]。在第一代ACI中,软骨细胞从健康软骨的活组织检查中分离,所述健康软骨从最小负载区域获得。软骨细胞在体外扩增,然后在活检后6周至18个月之间注射到患者体内[75]。为了避免软骨细胞从缺损部位渗漏,将骨膜补片缝合或使用纤维蛋白胶粘合以覆盖和密封该区域[76]。为了避免骨膜补片并发症和手术困难,开发了第二代ACI,称为基质辅助自体软骨细胞植入(MACI)。MACI是使用胶原蛋白或透明质酸基质与自体软骨细胞接种,插入到缺损部位或固定与纤维蛋白胶。基于透明质酸的MACI治疗软骨病变的临床结果显示长期随访的稳定性和低失败率[77,78]。与ACI相关的主要问题是供区发病率、软骨细胞分布不均匀和软骨细胞丢失同种异体移植物被用作替代方案,但软骨缺损边缘与供体移植物之间的整合不良会导致移植物失败[79]。这些治疗受到与用于修复的足够细胞的可用性以及修复组织的质量和数量相关的主要限制;由于这些限制,它们可能无法产生持久的修复。基于良好的临床结果,细胞疗法与生物材料一起可以成为修复关节软骨缺损的替代疗法修复关节软骨是非常具有挑战性的,因为其无血管和神经性质以及其稀疏的细胞群体。因此,选择合适的细胞来源非常关键。为此,各种研究人员采用了广泛的细胞来源来鉴定最佳的细胞来源,例如软骨细胞和MSC,包括骨髓、脂肪来源和滑膜来源的MSC[80这些细胞来源可以容易地分离,能够扩增,并且可以表达和合成大小软骨特异性分子(例如,II型胶原和聚集体),有或没有支架,用于成功的软骨修复[83]。随着医学科学和技术领域的进步,焦点已经转向使用生物材料进行软骨再生。迄今为止,各种各样的生物材料,包括天然和合成生物材料,已被用于递送细胞和其他信号以有效地再生软骨组织。几种不同的支架已经使用各种技术由生物材料制成,例如水凝胶、海绵/泡沫、纤维基质和分层结构。图2表示用于软骨修复的细胞-生物材料方法。3.2.1. 水凝胶水凝胶是具有高含水量的3D聚合物网络,其模拟天然ECM的含水量[84,85]。水凝胶通过物理或化学交联方法形成,并且是用于将细胞和生物活性分子控制释放到靶位点中的有前景的递送载体。交联的类型和程度影响水凝胶的重要性质,例如溶胀性质和弹性模量[84,85]。水凝胶也可以以注射剂的形式使用。20J.L.E. Ivirico等人/工程3(2017)16图二. 软骨修复的细胞生物材料方法。水凝胶,可以很容易地填充任何大小和形状的缺损,并可以微创方式植入[86]。已经测试了几种合成和天然生物材料用于开发用于软骨再生的水凝胶。用于开发水凝胶的最普遍的合成生物材料之一是聚乙二醇(PEG),因为其相对惰性和生物相容性。然而,PEG不支持软骨特异性基质的产生和软骨形成的产生,其水平与在其他天然材料如HA中观察到的水平相同[87]。因此,已显示将HA掺入PEG水凝胶中可改善PEG水凝胶的生物活性[88]。多聚赖氨酸(PLL)是一种天然多肽,由于其是骨髓间充质干细胞早期成软骨的刺激因子,PLL已显示在体外上调间充质凝聚,从而模拟软骨发育过程的阶段。将PLL掺入基于寡聚(PEG富马酸盐)(OPF)的水凝胶中,以评估发育生物学启发的软骨再生策略的功效。这些水凝胶导致II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖基因的早期上调以及包封的MSC中的缩合标记物N-钙粘蛋白基因的表达该研究表明,阳离子PLL诱导早期软骨形成标志物的表达,复制软骨发育的凝聚阶段[89,90]。藻酸盐水凝胶也已用于软骨再生,促进软骨细胞外基质的合成和软骨形成。藻酸盐化学结构上存在的负电荷诱导新合成的聚集蛋白聚糖分子的保留。然而,这些材料的局限性包括弱的机械稳定性、缓慢的降解和差的细胞粘附性。为了克服细胞粘附性差的问题,将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽序列(细胞粘附基序)固定在藻酸盐支架上。RGD固定证实了局灶性细胞粘附的形成,从而改善了细胞粘附[91]。胶原蛋白是软骨基质的重要组分;因此,已经研究了胶原蛋白水凝胶以支持软骨再生。胶原蛋白水凝胶在体外培养期间也收缩,这在细胞聚集和软骨形成分化的启动方面提供了优势,这与胚胎软骨形成中的事件相似[92]。CS是软骨基质的另一个重要成分,因此已广泛用于软骨再生。由于CS的弱机械性能,人们尝试通过掺入另一种材料如PEG来开发复合材料。已使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对CS进行修饰,以产生CS-NHS大分子单体,其可与六个PEG-胺臂反应,形成化学交联的水凝胶[93]。改变PEG-胺前体的pH导致CS-PEG水凝胶具有可调的机械、溶胀和胶凝性质。降低pH增加了胶凝时间、刚度和交联度,并降低了溶胀度。此外,CS-PEG水凝胶的粘合强度进行了评价,发现与纤维蛋白胶,一种常用的粘合剂,用于临床应用。这是由于其与ECM中含有伯胺基团的生物分子形成共价交联软骨再生最常用的水凝胶之一骨水泥是HA水凝胶,因为它富含软骨基质。丰富的官能团(-OH和-COOH)允许其化学修饰和共价交联。如第2.2节所述,HA广泛用于OA的粘弹性补充具有高MW的HA产生高粘性溶液,但在受损区域中保留很短的时间。对HA进行化学修饰是延长HA在体内作用时间和改善其力学性能最常用的方法水凝胶的机械和物理性能在很大程度上取决于交联密度。已经研究了使用不同官能团的HA的化学官能化(图3),允许在不使用潜在的细胞毒性交联剂的情况下形成水凝胶。HA的共价交联可以通过使用-COOH和-OH官能团的酯和醚键来实现(图3)。例如,已经使用过量的己二酸二酰肼(ADH)并在碳二亚胺/1-羟基-苯并三唑(HOBt)的存在下合成了二酰肼修饰的HA(HA-ADH)[94,95]。 此外,本发明还提供了一种方法,已通过高碘酸钠介导的氧化制备了甜菜碱修饰的HA(HA-CHO)[96,97]。HA水凝胶的物理和机械性质(胶凝时间、粘度、弹性模量和交联密度)可以通过改变进料混合物中HA-ADH和HA-CHO的比率来调节。HA-ADH和HA-CHO之间的反应导致形成腙键(C1=N1-N2H-(C=O)N3H),其在温度下不太稳定。J.L.E. Ivirico et al./ Engineering 3(2017)16-2721生理条件下,并迅速切除的溶酶体酶[98]。Oommen等人[99]设计了一种更稳定的HA系统,由HA-双酰肼(HA-CDH)和HA-醛组成。由于其化学结构中正电荷的离域,因此形成的腙键是稳定的且不可逆的。在酸性条件下,HA-CDH水凝胶的稳定性是HA-ADH水凝胶的15倍,储存模量(G′= 1196 Pa)比HA-ADH(G′= 297 Pa)高。此外,高碘酸盐介导的氧化影响HA的生物学功能(缺乏细胞识别),限制了其应用。为了保留HA的天然结构,Wang等人[100]设计了在温和条件下将醛部分接枝到HA上的合成路线。或者,HA水凝胶可以通过以下方法制备:使用双官能亲电试剂如PEG二丙烯酸酯的硫醇-迈克尔加成反应[101,102]。该反应可在生理条件下进行;其凝胶化动力学快速且在无催化剂的情况下进行。另一项基于硫醇的反应研究了使用硫醇化HA与PEG乙烯基砜在生理条件下产生3D水凝胶网络,降解速率和胶凝时间可调[103]。在此,通过增加聚合物浓度(从0.02 w/v至0.06 w/v)和HA MW(从45 kDa至185 kDa),凝胶化时间从14 min减少至小于1 min。水凝胶的生物降解性和机械强度取决于HA和PEG的分子量、聚合物浓度和巯基化HA的功能化程度。HA化学结构的修饰丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯部分是用于调节HA的化学和机械性能的甲基丙烯酸酯-HA水凝胶可以通过光交联连接到HA链的甲基丙烯酸酯基团,然后在暴露于紫外线(UV)照射时进行自由基聚合来实现Leach等人[104]描述了HA和甲基丙烯酸缩水甘油酯之间的交联反应。一系列甲基丙烯酸缩水甘油酯-HA(GMHA)缀合物产生具有不同和可控性质的GMHA水凝胶。高官能化程度的缀合物导致具有增加的交联密度和降低的降解速率的水凝胶。使用增强水凝胶如填料或纤维的复合方法具有改善水凝胶的因此,与使用增强填料如纤维素或其他性质的纤维一起,这些方法可用于改善水凝胶的机械性能[105]。研究人员尝试在纤维增强复合材料中复制天然软骨组织的复杂机械特性,使用3D编织聚己内酯(PCL)支架封装在纤维蛋白水凝胶中,并接种人脂肪源性干细胞。该支架开发了具有与天然软骨组织相似生物力学特性的功能性组织工程构建体[106]。上述水凝胶缺乏类似于天然软骨组织的带状组织。因此,正在开发新的策略来复制带状组织的天然关节,图3.第三章。HA的化学修饰。22J.L.E. Ivirico等人/工程3(2017)16软骨样组织,因为这种性质在控制天然软骨的机械行为中起着重要作用。开发了三层PEG基水凝胶,其中顶层含有CS和MMP-敏感肽(浅区,PEG:CS:MMP-pep),中间层含有CS(过渡区,PEG:CS),底层含有HA(深区,PEG:HA)。这种层状水凝胶促进了区域特异性软骨形成,并形成了具有空间变化的机械和生物化学性质的软骨样组织[107]。虽然已经开发了几种技术来增加水凝胶的机械性能,但水凝胶仍然缺乏分级组织,因此导致与宿主组织相比具有不同机械行为的各向3.2.2. 海绵/泡沫海绵是多孔支架,其性质由孔径、孔隙率和互连性定义。孔隙大小是组织再生的重要因素,因此,控制孔隙结构非常重要。迄今为止,已经采用各种方法来开发海绵,包括致孔剂浸出、冷冻干燥和用于软骨再生的气体发泡。已制备纯化藻酸盐海绵,以最大限度地减少免疫反应,并发现其支持软骨形成[108]。使用微流体装置制备多孔藻酸盐支架,以在凝胶化时产生藻酸盐液滴,并形成高度有序的多孔支架。支架保持软骨细胞表型,并促进小鼠背部皮下部位软骨样组织的形成[109]。另一项研究使用具有梯度孔的多孔胶原支架研究了孔径对软骨再生的影响,所述该支架显示出紧密堆积的球形孔,具有良好的孔互连性,并且在所有具有不同孔径的支架中孔隙率为98%。将构建体皮下植入六周龄小鼠的背部。研究表明,直径为150- 250 μm的支架由于在具有150-250μm孔径的胶原支架中具有较高的软骨形成基因活性,该系统用于递送胰岛素。负载有含有胰岛素的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微粒的多孔支架显示胰岛素的持续释放,这支持软骨细胞的存活和增殖[111]。已用作软骨再生多孔支架的其他材料包括丝、明胶、壳聚糖和HA[112然而,这些支架缺乏与天然软骨组织相似的具有不同组成和性质的带状组织。因此,最近的焦点已经转向开发类似于天然软骨的通过堆叠壳聚糖和PCL共聚物,与不同浓度的II型胶原共混,开发了多层多孔支架为了复制软骨组织层的胶原组成,从顶层到底层减少II型胶原含量(在支架中)。该研究表明,这些支架在组成、多孔结构、含水量和压缩机械性能方面与天然软骨相似的可行性[117]。另一项研究使用逐层技术结合使用壳聚糖和CS的模板沥滤开发了多层3D结构,这可以形成一种可降解的复合物。该构建体显示出受控的孔径、高达300%的吸水能力、粘弹性和支持MSC的软骨形成分化[118]。试图模仿天然软骨的带状组织是使用沉积在颗粒沥滤泡沫上的电纺PCL纤维进行的。双层3D支架包含上部对齐的纤维区域以模拟关节软骨的浅表区的形态,而本体多孔颗粒模板支架允许细胞浸润和广泛的ECM沉积。掺入的对齐纤维还增强了拉伸性能,多孔区域促进了接种软骨细胞的浸润,导致高增殖率和GAG产生[119]。由于使用合成聚合物,双层支架显示出改善的机械性能,合成聚合物通常缺乏诱导软骨生成的生化线索。然而,在这些支架中仍然没有实现天然软骨中存在的带状组织。3.2.3. 纤维网片/支架纤维网是非织造纤维和织造纤维的网络,其具有纤维直径和空隙体积的变化,这决定了细胞行为。使用纤维支架是因为它们的高孔隙率和互连孔,这可以提供更高的机械强度,但不能填充不规则的缺陷。微米级和纳米级纤维通常用于模拟天然软骨组织的ECM组分。已经进行了几次尝试来开发具有仿生机械特性和在植入后维持生理负荷的能力的3D纤维性骨瓣。开发了用均质化软骨衍生基质浆液渗透的3D编织PCL支架,并与人脂肪衍生干细胞一起培养长达42天。这些编织支架支持ECM积聚并保持机械性能[120,121]。静电纺丝支架也被研究用于软骨再生。静电纺丝法制备的纳米纤维作为软骨细胞外基质模拟物具有很大的潜力。尽管它们具有ECM模拟特性,但由于闭孔网络网格,纳米纤维遭受有限的细胞浸润。因此,为了克服这些限制,开发了具有可变尺寸的纤维(微纤维和纳米纤维)的支架。开发了含有两种不同尺度的纤维(微纤维和纳米纤维)的静电纺丝支架,所述纤维由两种离散材料(特别是纤维蛋白和PCL)组成。将纳米纤维并入微纤维网中,使得它们均匀地分布在整个构造中。与仅由微纤维组成的支架相比,纳米纤维和微纤维的存在改善了细胞增殖和GAG沉积[122]。该结果是由于组合的微纤维和纳米纤维保持的较大孔径以及纳米纤维与天然ECM的组分的密切相似性,从而改善了细胞反应(分化和ECM产生)[123]。更新的策略也正在开发中,以复制软骨的区域特异性组织和特性。一个三层的PCL为基础的支架开发连续的静电纺丝,其中纤维的大小和方向是不同的,在一个连续的结构。三层复合支架显示出与天然软骨组织相似的机械性能,并支持体外软骨形成[124]。用于软骨再生的纤维网的主要局限性是:①通过静电纺丝形成2D网,这导致软骨细胞变平,从而形成纤维软骨样组织;以及②发现纳米纤维静电纺丝支架具有高刚度,导致工程结构和宿主组织之间的机械不匹配[125,126]。由于已知胶原纤维控制软骨组织的机械变形,因此胶原纤维以3D对齐的方式编织。J.L.E. Ivirico et al./ Engineering 3(2017)16-2723图案以产生大孔。将MSC细胞团接种在这些大孔中,以复制间充质冷凝驱动的软骨形成。支架框架支持增强的软骨形成和机械稳健性,因此具有显著的软骨再生潜力[127]。纤维支架已显示出作为软骨ECM模拟物的潜力;然而,需要进一步的结构改进以复制天然组织的结构-功能特性。4. 骨关节炎的微创细胞治疗方法用于软骨再生的手术疗法受到主要限制,例如显著的术后感染和较长的住院时间。为了克服这些局限性,研究人员已经开始探索侵入性较小的治疗方法。已经获得了对用于治疗OA的干细胞疗法的新见解,其中干细胞分离自不同的组织来源(例如,骨髓、脂肪组织和滑膜),在体外扩增,并输回患者体内。MSC是一种有吸引力的细胞来源,可支持软骨损伤后的修复,这是由于:易于在体外扩增MSC;多谱系潜力;免疫抑制特性;以及促血管生成、抗纤维化、抗凋亡和伤口愈合特性[128]。MSC的免疫抑制特性促进促炎反应的下调,从而促进组织修复[129]。在各种来源的MSC中,骨髓来源的MSC(BMSC)作为用于汽车再生的细胞来源已被广泛研究。将BMSCs关节内注射到多个组织损伤的大鼠关节中,包括前交叉韧带(ACL)、内侧半月板和股骨髁软骨损伤,显示BMSCs动员到损伤部位并在细胞周围合成ECM的组织再生。此外,该研究报告称,注射较高数量的细胞(1 ×107个细胞)与注射1 × 106个 MSCs。然而,注射1 × 107个细胞导致瘢痕组织形成,该研究的作者认为这是使用较高细胞数量的不良反应和关节功能障碍的原因。因此,重要的是优化细胞数量。此外,使用适当的输送系统可进一步帮助开发更好的策略[130]。在另一项研究中,单次关节内注射自体将 2 ×106 细 胞 密 度 的 BMSCs 分 别 接 种 于 1 : 1 的 Ham'sF 12 :Dulbecco' sModifiedEagle培养基(F12/DMEM,FD)+ 1%胎牛血清(FBS)+ 5 ng·mL-1转化生长因子- β 3(TGF- β 3)+ 50ng·mL-1 胰 岛 素 样 生 长 因 子 -1 ( IGF-1 ) 的 软 骨 细 胞 培 养 基(CM)或FD + 10% FBS的基础培养基(BM通过全内侧半月板切除术和ACL切除术在绵羊中诱导OA注射后6周,与对照组相比,用CM和BM治疗的骨关节炎膝关节的软骨破坏和OA进展减少。对照组的病变评分最高,为3.44 ± 0.38分,其次是BM组,其病变评分较小,为1.22 ± 0.89分。CM组的病变评分最低,为0.8 ± 0.35分,病变较浅,边缘光滑该研究的作者得出结论,与BM和对照组相比,CM组观察到良好的软骨组织结构、厚度和质量这些研究证明了BMSC注射治疗OA的潜力[131]。基于有希望的临床前研究,几项临床试验为了了解关节内注射BMSC的潜力,最近完成了。Centeno等人[132,133]将MSC直接注射到膝关节;将MSC悬浮在PBS中并注射到患有退行性OA的患者的膝关节第2周再次注射10 ng·mL-1地塞米松1 mL随访3个月和6个月,患者软骨体积增加(达28.64%),OA患者疼痛本研究的局限性在于仅研究了1例患者,未研究长期效应[132,133]。Centeno等人[134]的另一项研究使用了更大的患者人群,并对BMSC注射的疗效进行了长达10.6 ± 7.3个月的随访。BMSC注射后,膝关节中未观察到肿瘤形成或肿瘤并发症的迹象[134]。Davatchi等人[135]和Emadedin等人[136]进一步研究了关节内注射BMSCs的安全性,Davatchi等人[135]使用2 × 107 -2.4 × 107 BMSCs对4例中度至重度膝关节OA患者进行了长达6个月的研究,据报告,患者注射后6个月疼痛显著减轻,行走能力改善然而,6个月后疼痛减轻或行走能力改善下降,表明需要第二次注射[135,136]。Orozco等人观察到关节内注射的结局更有希望[137],他们使用了比以前研究中使用的更高的细胞在这项研究中,研究人员在12名对保守治疗无反应的慢性膝关节疼痛患者中使用了4 ×107个自体BMSCs细胞临床结果随访1年。研究发现,疼痛在所有时间点均显著减轻,软骨体积快速且进行性增加[137]。Soler等人[138]进行了I期至II期临床试验,使用单剂量-15例膝关节OA患者关节腔内注射(4.09 ± 0.04)×107输注8天后,疼痛强度相对降低,即使在12个月后仍保持不变。即使在12个月后,身体功能和身体机能也有所改善,并有软骨再生的迹象[138]。这些研究显示了使用BMSC治疗膝关节OA的巨大潜力。然而,这些研究中使用的方案和细胞数量的可变性表明需要进一步优化[139,140]。与BMSC不同,从脂肪组织获得的脂肪来源的MSC(ADSC)可以使用侵入性较小的程序分离,并且可以大量获得[141]。关节内注射脂肪干细胞的研究在OA动物模型中取得了令人鼓舞的结果。Ter Huurne等人[142]研究了关节内注射ADSC对胶原酶诱导的OA小鼠关节的抗炎和软骨保护作用。ADSC抑制滑膜衬里增厚和软骨破坏,并保护关节免受合成代谢和分解代谢介质的破坏在兔OA模型中使用1 × 106 ADSC关节内给药进行类似的研究结果表明,动物对ADSC注射具有高度耐受性;它不产生免疫反应迹象,并显示OA临床体征减少,这可能是由于ADSC的抗炎特性及其低免疫原性。此外,关节内ADSC治疗已显示在不到3个月的时间内改善髋关节OA犬的肢体功能[142AD-SC也已作为替代细胞来源用于临床研究。Koh等[145]在30例患者的膝关节中注射了4.04×106个ADSC注射液可有效愈合软骨,减轻疼痛,改善老年患者的功能。作者还得出结论,ADSC注射是一种简单,24J.L.E. Ivirico等人/工程3(2017)16这是一种具有成本效益的方法,因为细胞可以在同一天收获并Jo等人[146]进行了另一项研究,他们在18名膝关节OA患者中给予不同剂量的ADSC-低剂量(1 × 107个细胞)、中剂量(5 × 107)和高剂量(1 × 108低剂量和中剂量组显示关节功能和疼痛减轻显著改善,而软骨缺损的大小此外,高剂量组显示覆盖缺损部位的厚透明样软骨[146]。这些研究的有希望的结果表明,关节内ADSC注射可作为OA的有效和安全的治疗方法。然而,该研究的主要局限性是细胞未被表征,因此可能含
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