ALS血脑共同基因差异表达及转录因子microRNAs影响研究

于二零一九年一月十六日（二零一九年）100193肌萎缩侧索硬化症患者血细胞和脑组织共同的马里兰州Rezanur Rahmana，J.，1，Tania Islamb，1，Fazlul Huqd，Julian M.W.奎恩·C，Mohammad Ali Monid，穆罕默德aKhwaja Yunus Ali大学生物医学学院生物化学和生物技术系，Sirajgonj，6751，孟加拉国b孟加拉国库什蒂亚伊斯兰大学生物技术和遗传工程系，邮编7003。c骨生物学部，Garvan医学研究所，Darlinghurst，NSW，2010年，澳大利亚d悉尼大学医学与健康学院，悉尼医学院，病理学学科，新南威尔士州，2006年，澳大利亚A R T I C L EI N F O保留字：肌萎缩侧索硬化症血脑共同基因差异表达基因蛋白质相互作用转录因子microRNAsA B S T R A C T肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进行性运动神经元疾病，其特征是控制随意肌的神经元死亡。ALS的早期诊断是困难的，并且检测在灵敏度和特异性以及成本方面受到限制。因此，从血细胞分析中检测ALS可以改善疾病的早期诊断和治疗。本研究的目的是确定血细胞转录本， 与ALS进展相关的因素的大脑表达水平。我们分析了血液和大脑中的血细胞和大脑转录组学基因表达数据集（RNA-seq和微阵列）。我们确定了13个差异表达基因（DEG; ALS与对照），这些基因在ALS血液和脑组织中通常失调，常见于血细胞和脑（DNAH 6、HLA-DMB、HLA-A、EHD 2、这些数据揭示了信号系统中重要的神经变性相关分子通路。这些不同分析的整合揭示了许多转录因子的失调，即SP1、MYC、TP3、CTCF和SRF。此外，我们鉴定了ALS中改变的microRNA：miR-29 c、miR-21、let-7a、miR-377、miR-103、miR-369- 3 p、miR-494、miR-204、miR-29 a。因此，我们已经确定了ALS受试者大脑中的病理过程和血细胞中的转录物之间可能的新联系，这可能使血液样本的使用能够诊断和监测ALS的发作和进展。1. 介绍肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进行性致死性神经肌肉疾病，主要影响上下运动神经元[1，2]。虽然绝大多数病例被归类为散发性ALS（sALS），即，在没有遗传易感性证据的情况下，少数病例（通常约为10%，但取决于遗传性定义的严格性）确实显示出家族性受累（fALS）的证据[3]。ALS的根本原因和驱动相关神经变性的机制尚不清楚，即使在指示基因参与的情况下也是如此。目前还没有治愈ALS的方法，并且缺乏可能改善诊断或帮助识别临床靶点的有用的临床生物标志物。患者组织中的遗传和转录水平可以帮助识别可能的新生物标志物，有助于确定ALS患者中惊人相似的表型这些研究已经确定了ALS受影响组织中RNA加工中断的作用，发现了编码RNA结合蛋白的基因中的fALS突变（Prasade等人[4]综述），如RNA剪接和转运因子TARDBP（TDP-43），其在神经元发育和调节601个基因的表达中很重要[5]，但也可以在细胞包涵体中积累。TARDBP突变占fALS病例的5%。其他RNA结合蛋白基因包括FUS [6]、TAF15、HNRNPA2B1、HNRNPA1、EWSR1和ATXN2 [7]。其中一些受TARDBP调控，但已经鉴定了超过15种具有一系列功能的其他ALS相关基因，其中许多（例如，SOD1）极大地影响转录组，许多微小RNA（miRNA）也是如此[4]）。TARDBP蛋白也与sALS有关，这表明更广泛的*通讯作者。Khwaja Yunus Ali大学生物化学和生物技术系，Sirajgonj，6751，孟加拉国。通讯作者。悉尼大学医学与健康学院医学科学院生物医学科学学科，悉尼，新 南威尔士，2006年，澳大利亚。电子邮件地址：rezanur12@yahoo.com（马里兰州）。R. Rahman），mohammad. sydney.edu.au（M.A. Moni）。1这两位作者对本书的贡献相当，是本书的共同第一作者。https://doi.org/10.1016/j.imu.2019.100193接收日期：2019年4月9日;接收日期：2019年5月13日;接受日期：2019年5月21日2019年1月2日的一份声明2352-9148/©2019由ElsevierLtd.这是一个不可避免的问题，因为CCBY-NC-NDLicense（http：//creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学杂志主页：www.elsevier.com/locate/imu马里兰州R. Rahman等人于二零一九年一月十六日（二零一九年）1001932从遗传突变中可以明显看出的作用。因此，识别ALS中RNA特征的特征以用于早期诊断或机制见解的策略似乎是有希望的。虽然ALS的发病机制可能是多因素的，但应用分子方法来改善ALS的诊断和评估尚未提供证实的结果，因此对外周血中早期ALS生物标志物的探索受到了越来越多的关注[8成功鉴定此类血液分子生物标志物可能对ALS的诊断、护理和治疗产生重大影响[8]。最近，有许多研究已经描述了人体组织[12已经在ALS中进行了几项基因表达谱研究，以表征其相关的mRNA特征[8然而，这些发现仅限于转录水平，因为没有考虑基因产物之间的功能相互作用。由于生物分子彼此相互作用以在细胞和组织中的生物过程中执行功能，因此网络医学背景下的综合分析对于理解疾病背后的分子机制和识别关键生物分子至关重要。因此，我们采用了一种综合方法来鉴定ALS的分子生物标志物特征，其使用转录组分析在外周血细胞和脑组织中在相似的遗传控制下表达。对ALS中称为核心DEG的脑组织和血细胞之间相互失调的DEG进行基因过表达分析，然后进行基因本体（GO）分析。然后使用途径富集分析来通过鉴定的DEG鉴定富集的途径。进一步分析这些DEG以鉴定调节因子，如转录因子（TF）和微RNA（miRNA），其可能影响ALS影响的组 织 中 这 些 DEG 的 水 平 。 本 研 究 特 别 关 注 转 录 水 平 （ mRNA 和miRNA）和翻译水平（中枢蛋白和TF）的生物标志物信号，如图1所示，以阐明ALS的致病机制并鉴定用于早期诊断的潜在生物标志物。2. 材料和方法2.1. 从高通量RNA-Seq和微阵列数据集中鉴定差异表达基因我们从NCBI-GEO数据库获得ALS患者的基因表达Illumina微阵列数据集GSE 28253（血液组织的外周淋巴细胞）和RNA-seq数据集GSE76220（运动神经）[20]。通过GREIN [21]分析RNA-seq数据（GSE76220），并确定了p值0.05和log 2绝对值的DEG，用于倍数对照FC≥2。<我们通过GEO2R在线工具应用微阵列（limma）的线性模型，以从外周淋巴细胞数据集（GSE 28253）中鉴定DEG。考虑两个数据集之间的重叠DEG进行进一步分析。使用Benjamini-Hochberg（BH）方法2.2. 基因集富集分析，以确定基因本体和分子途径我们通过Enrichr [22]和NetworkAnalyst [23]进行基因集富集分析，以鉴定重叠DEG的GO和途径。本体包括生物过程、分子功能和细胞成分三大类。将调整后的p值0.05视为所有富集分析的临界值标准<2.3. 蛋白质相互作用网络分析我们通过NetworkAnalyst[23]从STRING数据库[24]中选择400的中等置信度评分Fig. 1. 本研究中采用的系统生物学管道。来自肌萎缩侧索硬化症（ALS）的血液和脑组织的匹配对照比较研究的基因表达数据集从基因表达综合库（GEO）获得。分析数据集以鉴定脑和血液组织之间的共同差异表达基因（DEG）。通过富集分析确定了显著富集的途径和基因本体（GO）术语。分析蛋白质-蛋白质相互作用网络以识别枢纽蛋白。还研究了转录因子（TF）-靶基因相互作用和microRNA-靶基因相互作用以鉴定调控生物分子。在字符串交互组中。通过NetworkAnalyst进行网络可视化和拓扑分析[23]。使用拓扑学参数，使用度（大于15°）从PPI分析中鉴定高度相互作用的枢纽蛋白2.4. 差异表达基因为了交叉验证鉴定的DEG，我们通过将DEG与登录号为GSE 112680的另一微阵列基因表达数据集进行计算机交叉验证。该数据集是376个样本的ALS的全血基因表达谱我们分析了微阵列数据集，并基于校正的p值0.05和t统计量的绝对值≥1.5作为统计学显著性来鉴定DEG。<2.5. TF-miRNA共调控相互作用分析我们研究了从RegNetwork库[25]获得的TFs-miRNA共调节相互作用，以鉴定在转录和转录后水平调节感兴趣的DEG的调节性TF和miRNA。该网络在NetworkAnalyst中进行了分析[23]。2.6. 候选药物/小分子我们使用DSigDB：药物特征数据库基因集进行药物靶标富集或过度代表性分析[26]。马里兰州R. Rahman等人于二零一九年一月十六日（二零一九年）1001933表1ALS差异表达基因的功能富集分析，以确定基因本体论术语。总结了十大重要GO术语类别GO IDGO术语调整p值基因生物过程GO：0010759巨噬细胞趋化性0.0012THBS1; CMKLR1GO：1905523巨噬细胞迁移的正调节0.0012 THBS 1; CMKLR 1 GO：0002690白细胞趋化性的正调节0.0012 CCR 1; THBS 1;CMKLR1GO：0071622调节粒细胞趋化性0.0020 THBS 1; CMKLR 1 GO：0071675调节单核细胞迁移0.0020 THBS 1; CMKLR 1 GO：0032695负调节白细胞介素-12产生0.0020 THBS 1; CMKLR 1 GO：0010758调节巨噬细胞趋化性0.0023 THBS 1; CMKLR 1GO：0002576血小板脱粒0.0028 ITGB 3; PROS 1; THBS 1GO：0045055调节胞吐0.0042 ITGB 3; PROS 1; THBS 1GO：0043277凋亡细胞清除率0.0046 ITGB 3; THBS 1分子功能GO：0001637 G蛋白偶联化学引诱物受体活性0.0011 CCR 1; CMKLR 1GO：0019956趋化因子结合0.0011 CCR 1; ITGB 3GO：0004950趋化因子受体活性0.0011 CCR 1; CMKLR 1GO：0017134成纤维细胞生长因子结合0.0011 ITGB 3; THBS 1GO：0004896细胞因子受体活性0.0096 CCR 1; CMKLR 1GO：0005178整合素结合0.0131 ITGB 3; THBS 1 GO：0043184血管内皮生长因子受体2结合0.0304 ITGB 3 GO：0019957GO：0035173组蛋白激酶活性0.0304 CDK2 GO：0005172血管内皮生长因子受体结合0.0304ITGB3细胞组分GO：0042470黑素体0.0011 ITGB 3; RAB 27 A GO：0042611 MHC蛋白复合物0.0011HLA-DMB; HLA-AGO：0048770颜料颗粒0.0011 ITGB 3; RAB 27 AGO：0031091血小板α颗粒0.0011 ITGB 3; PROS 1; THBS 1G0：0055038再循环核内体膜GO：0031093血小板α颗粒管腔0.0075 PROS 1; THBS 1GO：0034774分泌颗粒腔0.0075 PROS 1; RAB 27 A; THBS 10.0173EHD2; HLA-AGO：0032585多泡体膜0.0275 RAB 27AGO：0031528微绒毛膜0.0275 ITGB33. 结果3.1. 肌萎缩侧索硬化症患者血与脑组织中共同表达基因的鉴定我们分析了ALS患者运动神经元和外周血淋巴细胞的高通量RNA-seq和微阵列基因表达数据集运动神经元和血液的转录组学数据集显示13个共同基因（DNAH 6、HLA-DMB 、HLA-A、EHD 2、CMKLR 1、PROS 1、GAPT、CCR 1、THBS 1、CDK 2、RAB 27 A、ITGB 3、和C1orf162）。为了阐明所鉴定的DEG的生物学意义，我们进行了基因集富集分析。重要的GO术语在生物过程、分子功能和细胞组分中富集（表1）。通路分析揭示了涉及移植物抗宿主病、同种异体移植物排斥、p53信号通路、抗原加工和呈递、EB病毒感染、细胞粘附分子、局灶性粘附、ECM-受体相互作用和肥厚型心肌病的重要通路（图1）。 2）。3.2. 蛋白质-蛋白质相互作用分析以鉴定枢纽蛋白构建了一个蛋白质-蛋白质相互作用网络，由DEG编码以揭示中心蛋白质，即考虑程度度量的所谓枢纽蛋白质（图3）。CDK 2、CCR 1、DNAH 6、HLA-A、EHD 2、THBS 1和RAB 27 A被鉴定为枢纽蛋白。这些是潜在的生物标志物，可能会导致新的ALS治疗靶点。3.3. 差异表达基因交叉验证的DEG差异表达显示，HLA-A、EHD 2、CMKLR 1、GAPT、THBS 1、CDK 2、RAB 27 A和C1 orf 162的表达差异显著（adj p-0.001）。值0.05）在ALS的基于血细胞的基因表达谱数据集GSE 112680中。0.05）。3.4. 转录和/或转录后调节因子我们鉴定了TF和miRNA及其靶向DEG，以揭示可在转录和转录后水平调节DEG表达的调节生物分子（图4）。分析揭示了TF（SP1、MYC、TP 3、CTCF、SRF）和miRNA（miR-29 c、miR- 21、let-7a、miR-377 、 miR-103 、 miR-369- 3 p 、 miR-494 、 miR-204 、 miR-205、miR-206、miR-207、miR-29a）在DEG的调节中发挥作用3.5. 候选药物/小分子本研究从DSigDB数据库中鉴定了候选小分子相互作用物（表2）。通过这种方式，我们确定了在基因列表中富集的候选相互作用化合物;这些可能表明有用的药物和药物靶点，尽管应该注意的是，这些与血细胞中的基因表达有关4. 讨论ALS的外周血生物标志物的缺乏已经导致努力鉴定用于这种衰弱性疾病的早期诊断的非常需要的方法。外周生物标志物的鉴定也可以阐明ALS的分子机制，并能够监测治疗。转录组学分析（通过RNA-seq和微阵列）广泛用于鉴定许多疾病的候选生物标志物[27一些研究旨在编码mRNA表达特征[8-14 ];例如，van Rheenen及其同事从血液基因表达谱中鉴定了ALS中的2943个尽管马里兰州R. Rahman等人于二零一九年一月十六日（二零一九年）1001934图二. 肌萎缩侧索硬化症患者脑组织和血细胞共有的差异表达基因丰富了重要的KEGG通路（p值<0.05）。图三. 肌萎缩侧索硬化症脑组织和血细胞共有差异表达基因的蛋白质相互作用网络。节点表示DEG，边表示两个基因之间的相互作用。见图4。基于ALS患者血细胞和脑组织共有差异表达基因的转录因子-miRNA共调控相互作用网络分析表2使用DSigDB基因集在药物靶标富集或过度代表性分析中鉴定的前10种药物。药物/化合物p值基因氯吡格雷0.000116 ITGB 3; THBS 1硫酸铍0.000285ITGB 3; HLA-AZebularine 0.000451 CDK2; THBS1辛伐他汀0.000897 CCR 1; CDK 2; THBS 117-乙炔雌二醇0.000897 CCR 1; PROS 1; THBS 1染料木黄酮0.006539 ITGB 3; PROS 1; CDK 2; THBS 1地塞米松0.002279HLA-DMB; CDK 2; THBS 1雌二醇0.011076 EHD 2; ITGB 3; PROS 1; CDK 2; HLA-A; THBS 1; CMKLR 1甲羟孕酮醋酸盐0.00182 CDK 2; C1 ORF 162; THBS 1阿司匹林0.005114 ITGB 3;CDK 2; THBS 1这些研究提供了一些候选生物标志物，但迄今为止还没有研究报告我们分析了来自ALS患者的外周血和脑运动神经元的两个基因表达数据集，试图鉴定在血细胞和脑组织中类似调节的潜在生物标志物候选物。我们的分析揭示了DEG以及TF和miRNA在转录和转录后水平强烈影响基因表达。我们的分析揭示了血液和脑组织的两个转录组数据集共有的13个DEG。基因富集分析还揭示了ALS相关的分子信号传导途径，包括细胞粘附分子、抗原加工和呈递。我们鉴定的p53信号通路已经涉及导致ALS中脊髓运动神经元死亡的细胞凋亡[32，33]。本研究中还确定了粘着斑、ECM相互作用和细胞粘附分子（CAM）等途径，这与Kotni等人研究ALS基因表达谱的类似结果一致[34]。利用蛋白质-蛋白质相互作用网络，我们还鉴定了参与许多细胞过程的失调中枢蛋白。这些中心蛋白被认为是疾病马里兰州R. Rahman等人于二零一九年一月十六日（二零一九年）1001935发展[35]。因此，我们重建了蛋白质相互作用网络集中在DEG，试图找出相关的枢纽蛋白。这些蛋白质有可能促进ALS的形成和进展。在我们鉴定的DEG中，ALS患者运动神经元脊髓中CDK2表达的mRNA水平显示出在ALS中的潜在作用[36，37]。Misra et al.讨论了HLA-A在神经退行性疾病中的作用[38]。Satoh等人确定了ALS中各种胶原基因（包括THBS1）的下调[39]。现在越来越多地研究调节生物分子作为重要病症如神经退行性疾病的潜在生物标志物[27，28，30，40考虑到这一点，我们研究了TF和miRNA在MS发病机制中通过TF-miRNA共调节网络调节DEG中的作用。在TF中，我们鉴定了SP1，其参与血管内皮生长因子的改变[43]，并显著参与多发性硬化症，另一种神经退行性疾病[44]。TP 53编码p53，p53是DNA修复和肿瘤发生的中心，但也与TP 53相关，包括Li-Fraumeni综合征和成骨肉瘤。其相关途径包括凋亡调节和信号传导以及胶质瘤。与该基因相关的基因本体论（GO）注释包括DNA结合转录因子活性和蛋白质异源二聚化活性。CTCF作为基因组调控和基因表达中的多功能蛋白[43]。miRNA在基因调控中发挥重要作用，并且有新的证据表明其用作ALS和其他疾病的生物标志物的潜力，并且很可能许多miRNA在ALS的致病过程中发挥重要作用[45Di Pietro等人表明，miR-29 c在ALS缓慢组中显著上调[48]。miR-369- 3 p在ALS的脊髓中上调[49]。let-7a参与抑制鼻咽癌的迁移和侵袭[50]。mir-494- 3 p可能在运动神经细胞的存活中发挥保护作用，这一发现可能导致ALS新疗法的开发。miR-29 a在阿尔茨海默病中减少[51]。最后，我们鉴定了药物/化合物，因为鉴定的生物标志物（即，中枢蛋白和转录因子）可能是ALS中产生药物再利用假说的药物靶点因此，发现了鉴定的ALS标志物和药物之间的关联，这表明它们可能影响疾病进展中的重要途径，但需要进一步研究来评估所提出的生物标志物阻断的后果。5. 结论在本研究中，我们分析了血细胞和脑组织的转录组学，以确定ALS中我们将这些常见的DEG整合到蛋白质-蛋白质相互作用、TF和miRNA的通路从ALS患者血细胞和运动神经元的RNA-seq和微阵列数据中鉴定出13个DEG。神经退行性变相关的分子信号通路被确定;几个TF和miRNA被确定为我们确定的DEG的假定的转录和转录后调节因子因此，我们已经确定了潜在的生物标志物转录，通常在ALS的血细胞和脑组织中失调。此外，我们确定了靶向所确定的生物标志物的候选药物。我们建议，这些生物标志物可能使快速和成本效益的评估血液样本分析诊断ALS。这种鉴定标志物的新方法可以在容易接近的组织（血液）中使用，以评估其在不可接近的组织（脑）中的表达，并且是可以应用于其他相关临床问题的方法。我们现在提出了一个更详细的验证这种方法和假定的生物标志物转录本，我们已经确定与临床为基础的调查。利益冲突声明作者声明无利益冲突。资金这项研究没有得到任何资金支持。作者贡献概 念 化 ： M.R.R. ， 和 M.A.M. 形 式 分 析 ： M.R.R. ， T.I.; 方 法 ：M.R.R.，T.I.和M.A.M.监督：F.H.，J.M.W.Q.和M.A.M.原始草稿：M.R.R.编辑：M.R.R.，J.M.W.Q.还有M.A.M.伦理声明本研究不需要我们机构的伦理审查。致谢我们要感谢我们的同事为改进手稿提出的建议。引用[1] 德卡瓦略湾解决ALS的诊断延迟。《柳叶刀·神经病学》2015;14：457-8。https：//doi.org/10.1016/S1474-4422（15）00020-4.[2] 基尔南MC。ALS和神经肌肉疾病：寻找圣杯。《柳叶刀·神经病学》2014;13：13-4。https：//doi.org/10.1016/S1474-4422（13）70226-6.[3] Ling S-C，Polymenidou M，Cleveland DW. 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