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第九届国际会计师联合会控制教育进展国际自动控制联合会,俄罗斯下诺夫哥罗德,2012年生物过程控制第2部分:生物过程设计,建模,模拟和发酵执行Ruben Knapp*,Jan-Hinrich Rabe*,Sebastian Kirchgäßner*,Winfried Storhas*,Martin J.沃尔夫 *** 曼海姆应用科学大学,技术微生物学研究所,曼海姆,德国(电子邮件:RubenKnapp@web.de,janhinrich. online.de,seb. gmail.com,w. hs-mannheim.de)** 曼海姆大学,曼海姆,德国(电子邮件:mjwolf@uni-mannheim.de)翻译后摘要:这第二篇论文的发展生物技术教学实验的重点是生物过程本身:后识别的要求,生物过程适合为学生的实验室实验,所选的过程的数学模型,详细介绍了分批,分批补料,连续操作模式。非线性动力学的线性化揭示了系统既不是完全可控的,也不是完全可观察的-给出了这个问题的生物学原因和解决方案。对于补料分批操作,Simulink仿真环境的能力,以模拟不同的进料策略进行了简要描述。通过专门定制的学习材料(“来自学生的学生”),掌握“漂亮”的模拟数据和真实世界的传感器信号之间的差异。一些意见的发展适应菌株的微生物的培养基作为基础,成功的发酵执行结束本文。关键词:过程控制,生物技术,数学模型,系统分析,信号调理。介绍从曼海姆应用科学大学的生物技术新硕士课程开始,继承了旧的德国本课程于2010年夏季学期首次授课,此后每学期都开设。为了使学生更深入地了解生物过程自动化中涉及的所有学科的不同观点,问题,需求和解决方案,开发了一个教学实验,并根据PRAE讲座的内容不断完善。它涵盖了从建模,系统分析,控制器合成,观察器设计,仪器仪表,培养基制备,灭菌,微生物对限定培养基的适应(“菌株开发”),实际发酵本身的执行,下游处理,感官数据调节,放大考虑,甚至生物反应器的最终清洁的过程的完全自动化。用于实验的完整硬件设置已经在先前的提交中描述(Wolf等人,2012年)。本文现在完整地描述了生物过程本身-产即将发表的一篇论文将深入探讨实验的整体教学概念和明显的实验2. 发酵过程在发酵过程中,微生物生长到高细胞密度,同时合成所需的蛋白质作为产物,其用于例如化学和/或制药工业。在所考虑的过程中,海洋细菌Vibrio natriegens在高盐培养基中培养,乙酸盐为产物,丙酮酸盐为碳源(C-源)。该成分确定培养基基于先前工作(Berdalet,1995)中的成分确定丙酮酸盐培养基(KTP),并添加了微量元素。在这个开发的第一阶段,发酵仅以分批操作进行(参见图1)。秒2.2),然而,它也在补料分批和连续操作模式下数学建模(第2.2节)。2.3和2.4)。在一个批次中,所有的离析物从一开始就存在于发酵罐中;除了通风之外,后面什么也不添加。因此,所有状态变量都在不断变化。虽然只有极少数的性质,如pH值和温度,可以真正控制在一个批次,分批操作模式形成的基础上了解该过程。批处理模型,此外,很容易扩展到其他模式的操作,并观察员的设计。因此,在本实验中彻底检查了批处理模式。非线性模型也被线性化,使PRAE讲座中教授的基本线性系统理论的适用性。生长曲线是典型的两个基板上的批量生长(二次生长),见图1。在约1.5小时的滞后期后,微生物开始生长,并且底物丙酮酸被降解,直到约1.5小时后耗尽。4小时丙酮酸用于细胞生长和细胞分裂,也可降解为产物乙酸。乙酸盐本身在丙酮酸盐耗尽后最终代谢,这(仅)出于教学原因是有利的效果。为了© 2012 IFAC 384 10.3182/20120619-3-RU-2024.000342012年6月19日至21日,俄罗斯下诺夫哥罗德,国际会计师联合会第九届研讨会385描述了该过程,通过克拉克电极在线测量反应器中的溶解氧。此外,通过光度法在线测量总生物量,并通过干燥和称重离线测量总生物量。通过色谱法(HPLC)离线测量底物丙酮酸盐和产物乙酸盐。Fig. 1. 由状态变量表示的发酵(产钠弧菌)的代谢活性和生长曲线:产物(乙酸盐)浓度、底物(丙酮酸盐)浓度、总生物量-生物干质量以及OD600与倍增因子和氧浓度-溶解氧DO,用于计算液相中的氧浓度cO22.1 需求分析:在工艺开发和分析之前,必须满足一系列要求。这些要求对于学生自己或在最小的帮助下进行实验非常重要。首先,发酵培养基和微生物必须足够: 培养基的高盐度可防止几乎所有其他微生物的生长,降低生物污染的风险。这增加了该过程对学生体验的影响 虽然S1实验室是可用的,但使用非转基因微生物增加了过程的安全性,特别是如果在发酵过程中发生问题。 当在脑心浸液上生长时,产钠弧菌具有9.8分钟的低世代时间(Eagon,1962)。这导致发酵时间相对较短,因为实验应该在一天内进行,这是教学实验所必需的。这很重要,因为重点不应该是发酵本身,而是监测和控制它背后。 与之前的要求相比,发酵的成本也应该是合理的,这导致了对培养基和执行时间的妥协,见下文。产钠弧菌也经常在复杂培养基上培养,如含甘油的肉提取物培养基(MEG)。初看起来,复合培养基(MEG)与确定的丙酮酸盐培养基(DEG)相比具有许多优点。以下条件下,产钠弧菌的比生长速率更高,滞后时间更短:在MEG培养基上生长的细胞密度比在DMEM培养基上生长的细胞密度大:细胞密度通过光密度测量; MEG培养基产生最大光密度。然而,与MEG相比,MEG具有至关重要的优势,对于正确的过程描述是不可或缺的: 碳源提供了以适当的方式平衡碳源的底物浓度的可能性。 它几乎符合水的吸收特性。因此,与MEG相比,基质干扰引起的负面影响有限。这对于通过光学在线监测细胞密度或底物和/或产物浓度的进一步工艺开发是重要的。 在低规模反应中,相对于MEG,MEG产生较少的泡沫。发酵产生的结果是,仍然需要消泡剂洗涤剂,但如果需要,可以减少量。 在发酵过程中减少使用消泡剂洗涤剂对气液界面中的氧传质有积极影响。较高浓度的去污剂聚丙二醇(PPG)导致kL a值降低,并因此导致向细胞的氧转运降低(Morão等人,1999年)。 较低的吸收率和较低的起泡倾向对于随后的在线测量至关重要。例如,由于基质的较低吸收,背散射探针具有较低的基质效应。较低的起泡倾向可以改善用于使用样品环的在线测量的发酵液的泵送。 复杂介质有一些普遍的缺点:它们的组成因电荷而异,并且通常无法通过现有的分析方法很好地定义。因此,这一事实使过程控制和监测复杂化,特别是对于学生实验。 为系统特性选择的状态变量必须是可用提供的仪器测量的。2.2 分批发酵动力学2.2.1 系统平衡重要生物量XV的形成取决于当前重要生物量的浓度XV(t)[g/l]和生长速率µ [1/h](1)。死亡生物量XD(t)[g/l]类似地用作用于当前生命生物量XV(t)的死亡率KD[1/h]建模(2)。总生物量XO(t)[g/l]由活生物量和死生物量组成(3)。底物丙酮酸的降解是所形成的生物质的功能,所形成的生物质消耗底物用于产物形成、细胞生长、细胞分裂和维持。维持是维持细胞过程所需的能量,如蛋白质生产或细胞运动。维持因子MF[1/h]嵌入在微分方程(4)中。µ1 [1/h]表示在第一底物丙酮酸盐上的生长速率。α[1/h]和β[-]分别为生物量相关常数。生长相关的产物形成。产率系数Y [-]是指生物量X、底物S和产物P。产物乙酸盐通过丙酮酸的酶促转化形成,并且其也用作细胞生长的底物,2012年6月19日至21日,俄罗斯下诺夫哥罗德,国际会计师联合会第九届研讨会386O丙酮酸耗尽后的细胞分裂。因此,产物的形成和降解是当前生物质浓度XV(t)(5)的函数。µ2 [1/h]表示消耗主要底物丙酮酸后,微生物在第二底物乙酸盐上的生长速率。(一)(二更)(三)(四)(五)根据双膜理论,氧是平衡的。液相中氧的变化由氧-代 谢 途 径 首 先 被 抑 制 , 因 为 底 物 丙 酮 酸 优 先 代 谢(10)。KS,2 [g/l]和KO,2[g/l]也是丙酮酸盐和氧的饱和常数。Ki[-]是以b加权的底物抑制常数。(九)(十)死亡率由三项组成(11)。第二项和第三项描述了死亡率对实际丙酮酸盐或乙酸盐浓度的依赖性,因为微生物由于饥饿而死亡。(十一)OTR由比传质系数kL a [1/h]、液相中O2的饱和浓度cO*[g/l]及其实际O2浓度:cO(12)表征。Gen转移率的液相,命名为OTR,和2从液相转移到细菌,称为氧摄取率OUR(6),其中cO2 [g/l]表示氧2(十二)液相中的浓度。(六)c*浓度用平均压力计算2[bar],O2的分子量[g/mol],空气入口中的O2[-]和水中O2的亨利系数[bar l/mol](13)。测定溶解氧DO [-]开始时的滞后期,细胞在接种后,适应新的环境条件,可以通过控制变量Q使用逻辑函数进行建模,其中丙酮酸盐的最大比生长速率为µmax,1 [1/h],参 见 ( 7 ) 。 Q [-] 是 与 细 胞 的 生 理 状 态 相 关 的 量(Baranyi,1994)。(七)2.2.2 生长模型和输运动力学微生物的生长阶段是根据经典的莫诺动力学建模。这里,总生长速率分为底物丙酮酸盐上的生长μ1、产物乙酸 盐 上 的 生 长 μ2和 表 示 缺 乏 可 用 底 物 的 死 亡 速 率 Kd(8)。(八)用克拉克电极在发酵过程中计算液相中的实际氧浓度cO2(14)。(十三)(十四)氧摄取率OUR通过经验方程描述为当前生物质浓度的函数(Knapp,2012 b)。微生物消耗氧气用于丙酮酸盐和乙酸盐的生长以及维持代谢(15)。丙酮酸盐的比生长速率取决于液体体积VR,L [m³],其中指数g0 [-]作为体积因子。我们的F是一个比例因子[-]。底物丙酮酸µ1上的生长是限制性底物丙酮酸当前浓度的函数,(十五)溶解在液相中的氧cO2(九)、KS,1[g/l]和2.2.3 参数估计K0,1 [g/l]是饱和常数。最后一项表示具有变量Q的滞后相位建模。Q的初始值远低于1,并且还在上升。因此,它在开始时对µ1有很大的影响,但随着时间的推移而减少。除了丙酮酸盐的生长外,产钠弧菌还以µ2的生长速率代谢2012年6月19日至21日,俄罗斯下诺夫哥罗德,国际会计师联合会第九届研讨会387产物乙酸盐。这使用软件工具Berkeley Madonna通过曲线拟合进行参数估计。因此,使用数值积分法Runge/Kutta 4,见图2。将总生物量X0(黄线)拟合到以g/l计的生物干质量的测量值(黑色数据点),将底物S(黑线)拟合到测量的丙酮酸盐2012年6月19日至21日,俄罗斯下诺夫哥罗德,国际会计师联合会第九届研讨会388通过HPLC(红色数据点)测量的乙酸盐浓度(g/l),将乘积P(红线)拟合到通过HPLC(绿色数据点)测量的乙酸盐浓度(g/l),并将溶解氧DO(绿线)拟合到从pO2-电极(蓝色数据点)产生的数据。丙酮酸和乙酸耗尽后,生命生物量(洋红色线)略有下降。相反,死亡的生物质是由于饥饿而形成的(青色线)。XO、S、P和DO的拟合仅显示出与其各自数据集的低偏差。2.2.4 线性化在产钠弧菌发酵的情况下,动力系统的非线性轨迹由六个状态变量XD(t)、XV(t)、S(t)、P(t)、cO2(t)和Q(t)确定,如等式(16)所示。系统的输入是输入到发酵液中的氧气。产品浓度是系统(十六)(十七)表1. 发酵F6的操作点与状态变量的相应值。发酵时间1小时3小时4.75小时操作点123XD(t=tOP,j)0.0230.0820.278XV(t=tOP,j)0.5821.1172.128S(t=tOP,j)4.4252.2130.0P(t=tOP,j)0.0330.7760.359cO2(t=tOP,j)0.0070.0060.006Q(t=tOP,j)0.0742.0939.51(十八)为了线性化,将生长曲线分为三个操作部分:滞后期(从接种到2 h)、指数生长期(从2 h到4 h)和稳定期(从4 h到5.5 h)。为工艺的每个部分选择一个操作点:三个操作点分别为发酵1 h、3 h和4.75 h后。状态变量的相应值从拟合的麦当娜模型读取,并且在其各自的阈值处用于雅可比矩阵计算。各时间点(参见表1)。作为示例,在等式(18)中给出了用于操作点1的特定系统矩阵A。2.2.5 系统分析对所研究的发酵过程进行了可控性和可观性检验。为了检查可控性,根据卡尔曼计算控制矩阵。对于例如操作点1,参见(19),系统被证明不是完全可控的。这是可以理解的,因为Xd和Q不能独立于例如重要生物质Xv来控制。但是,由于控制Q和死生物量XD永远不会是任何过程操作的目标,因此仅检查模型的其余部分仍然有效。(十九)因此,系统阶数减少到n-2(忽略状态变量XD和Q);再次检查可控性,并证明该模型对于所有操作点都是完全可控的。同样,可观测性矩阵也是根据卡尔曼确定的。整个系统也被证明是不完全可观察的。还检查了n-2约化系统的可观测性,现在证明它是完全可观测的。图二. 使用多曲线拟合对变量XO(黄色)、Xv(品红色)、S(黑色)、P(红色)、DO(绿色)和XD(青色)进行参数估计。非线性过程被分割成三个线性化的操作部分。设计一个合适的观测器2.3 补料分批发酵除了传统的分批发酵,还有两种操作模式:“补料分批”和“连续”。以补料分批2012年6月19日至21日,俄罗斯下诺夫哥罗德,国际会计师联合会第九届研讨会3891Y12在该模式中,发酵开始时仅利用最大可能反应液体体积的一部分,而剩余体积随后随时间推移作为底物进料添加。例如,如果高底物浓度对细胞代谢产生抑制作用,则这是必要的。2.3.1 动力学:与分批方程相比,补料分批发酵的微分方程的不同之处如下:体积随时间的变化V(t)可以描述为初始体积V0和体积输入t的总和,参见(20)。可以是常数,也可以线性或指数增长。所有这些不同的操作模式都可以在相关的Simulink仿真环境中进行仿真,见图3。尽管指数补料为指数生长的细胞提供了方便的底物供应,但这些补料策略的主要缺点是它们与工艺参数无关。为了优化,进料可以改为调节底物(或生物质)浓度和反应液体体积。这防止了反应器溢流并将底物保持在最佳浓度。2.4 连续发酵连续发酵的微分方程组V(t)Vo 吉尔夫·吉尔特(二十)与补料分批发酵没有太大区别。在连续发酵中,随着时间的推移添加底物,类似于增加的反应器体积导致稀释率D,其取决于输入体积与当前体积(21)的比率。到补料分批发酵。此外,反应介质被永久排出以在反应肉汤中实现恒定浓度。当dX/dt = 0时,达到该稳态/V(二十一)dS/dt = 0。它允许在最佳条件下长时间运行该过程,并永久收获产品,因此优化了空间-通常,在补料分批期间补料(Sα)底物发酵,但没有产物或生物质。因此,底物浓度如公式(22)所述不同。必须考虑到补料会稀释培养基。 因此,生物质(23)和产物(24)(24)必须相应调整:时间屈服在实践中,稳态可以通过两种方式之一来实现:在恒化器的情况下,由于恒定的体积流入和流出,反应器的液体体积保持恒定:稳态自动出现在浊度调节器中,DTX(t)1X/S X(t)YX/P MFX(t) S(t)(二十二)测量生物质浓度并通过调节流量保持恒定。高的测量和控制工作的浊度恒定器,使其几乎无关的工业。dX(D)X(t)DTdP()X(t)X(t)dtX/P DP(二十三)(二十四)在恒化器中,当达到稳态时,稀释率D等于生长率μ。然而,稀释度不应超过临界值Dcrit,其等于底物流入的生长速率,参见(28),以防止培养物的冲洗:2.3.2喂养策略D临界值 最大S (二十五)图三. 补料分批发酵的几种补料策略的Simulink模型及其对体积的影响(蓝色):不连续/脉冲(灰色),连续/恒定(橙色),间歇/间歇(蓝色)线性增加(绿色)和指数增长(红色)。通过正常进料增加体积和基质是关键的设计决策之一:进料可以例如不连续地施加;这里基质以规则的间隔脉冲进料。连续进料是另一种策略:YK2012年6月19日至21日,俄罗斯下诺夫哥罗德,国际会计师联合会第九届研讨会390尽管连续发酵具有很高的潜力,但所需的工艺知识对于大多数工业应用来说并不充分。此外,微生物的遗传稳定性不能得到保证,并且突变的可能性造成产品损失。最后,整个过程需要高度的无菌性,以防止生物污染,这可能导致完全损失。3. 模拟数据与真实世界的模拟信号:信号调节根据美国食品和药物管理局2004年的指导方针,应使用过程分析技术(PAT)开发新的制药工艺。其目的是加强对生产工艺的理解、优化和控制,从而提高所生产药品的质量(美国食品药品监督管理局,2004年)。利用微生物或细胞培养是当前创新药物的关键技术之一。在这2012年6月19日至21日,俄罗斯下诺夫哥罗德,国际会计师联合会第九届研讨会391在这方面,实施新的工艺分析技术和加强工艺控制有助于满足PAT倡议所要求的良好生产规范(GMP)的质量要求以及工艺文件和控制要求。对于生物技术专业的学生来说,10、接近7-8小时另一方面,实验系列中的细胞密度仅提高了10%。致谢作者要感谢Dipl。Ing. (FH)迈克尔一个重要的未来职业领域相对更糟的是, 曼海姆 大学 应用科学和因此,不仅要了解常见测量方法或即将到来的技术(如在线光谱学)的功能原理、优点和缺陷,而且要熟悉传感器信号的产生、传输、采样、重建和测量数据的解释-因为科学家经常面临由于生物变异或原材料杂质造成的困难,最终产品或甚至微生物引起的测量信号的干扰。此外,在大型生产现场,数据可能会失真,因此,有意义的数据可能会与无关紧要的“噪音”混在一起。干扰量和干扰信号使获得足够用于过程记录和自动化的数据变得复杂。因此,在某些情况下,建议在将传感器信号用于发酵控制或可视化之前对其进行处理,以避免错误。为了满足这一要求,学习材料涵盖了信号处理的基本概念的广泛概述,包括不同类型的滤波器的特性,以及滤波器的设计和Simulink中的应用,在学期结束时提供给学生进一步的自我调节学习。为了确保高度的可访问性,学习材料是与以前的学生合作开发的(Kirchgäßner,2011年),考虑到参加过课程并达到相同过程自动化知识水平的学习者的观点。因此,学生能够加深对该主题的理解,重建和应用额外学习材料中提供的示例,从而掌握自己设计,实施,部署和验证基本信号调理应用的模拟和数字滤波器的进一步关键技能。虽然编写学习材料的工作已基本完成,但试验中要执行的学习任务仍在进行中。4. 前提条件:天然弧菌对特定培养基在5个摇瓶实验过程中,微生物经过多代培养适应培养基(Knapp,2012 a)。这允许筛选微生物以增加适当代谢酶的产生。这些实验在相等的条件下进行,这意味着几乎相等的接种密度(在实验开始时相等的生物质浓度)。此外,细菌培养物总是处于生长曲线的相同代谢状态。通过这些实验,滞后时间从4小时减少到约3小时。达到稳定相的时间(见图3中的操作部分3(2)缩短稀释液- Ing.弗兰克Stolzenberger,海德堡大学,为他们的专业和专门的技术支持,以及德里克里斯,华盛顿大学,和Silke Weiden,HDZ,弗莱堡大学,校对和改进这份手稿。引用Baranyi J.,罗伯茨T. A.(1994年)。预测食品中细菌生长的动态方法。国际食品微生物学杂志,(23),280。Berdalet E.,帕卡德·T拉加塞湾罗伊·S圣阿芒湖,Gagné J.P.(1995)。海洋产钠弧菌的CO2产生、O2消耗和异柠檬酸脱氢酶. 水生微生物生态学,(9),211-217.伊贡河G.(1962年)。产钠假单胞菌,一种产生时间少于10分钟的海洋细菌。细菌学杂志,(83),736。美国食品药品监督管理局(2004年)。行业PAT指南-创新药物开发、生产和质量保证框架。美国食品药品监督管理局,马里兰州罗克维尔。Kirchgäßner,S.(2011年)。发酵过程的信号调理。曼海姆应用科学大学实验室项目。纳普河(2012 a)。用于产钠弧菌发酵的选定确定培养基的性能分析。曼海姆应用科学大学实验室项目。纳普河(2012(b)。发酵过程的基于模型的开发,包括系统分析,用作过程自动化的教学实验。曼海姆应用科学大学硕士莫朗·A玛亚角一、丰塞卡湾M. R.,Vasconcelos J. M. T.,阿尔维斯S.(1999年)。添加消泡剂对搅拌发酵罐气液传质的影响,生物工艺工程,(20),165-172。Seidel , G. ( 1999 年 ) 。 Kultivierungen mit einemHoopestungsstamm von Acremonium chrysogenum inkomplexen und synthetischen Medien -prostigien zurProduktivitätssteigerungunterBerücksichtigungderEnzymaktivitäten der Cephosporin C-Biosynthese ,Dissertation,Universität Hannover.Storhas , W. ( 1994 年 ) , 生 物 复 苏 和 外 围 疾 病 。Friedrich Vieweg Sohn Verlagsgesellschaft mbH ,Braunschweig/Wiesbaden.Wolf,M.J.,Ninov,V.,Babel,H.,Hütter,K.,施陶特河,Storhas,and Badreddin,E.(2012年)。生物过程控制教学实验第一部分:硬件设置。2012年在俄罗斯下诺夫哥罗德举行的第九届国际会计师联合会控制教育进展研讨会上接受出版
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