萝卜根部分纯化蛋白和低分子肝素对小鼠艾氏腹水癌的抗肿瘤作用的研究

制作和主办：Elsevier埃及生物多样性和生物多样性科学杂志1（ 2014）88e96可在www.sciencedirect.com在线获取ScienceDirect杂志主页：http://ees.elsevier.com/ejbas/default.asp完整文章萝卜根部分纯化蛋白和低分子肝素对小鼠艾氏腹水癌莱拉·A Eissaa，*，Salem A.作者声明：David B.阿卜杜勒·穆萨维ba埃及曼苏拉大学药学院生物化学系b埃及新达米埃塔，达米埃塔大学理学院，化学系，生物化学系A R T I C L E I N F O文章历史记录：收到日期：2014年1月20日收到日期：2014年2014年5月15日接受2014年7月2日在线发布保留字：转化生长因子-b1血管内皮生长因子艾氏腹水癌低分子肝素A B S T R A C T从萝卜（Raphnussativus）根中部分纯化的蛋白质。sativus）和低分子量肝素（LMWH）对艾氏腹水癌细胞（EAC）生长的抑制作用。将90只小鼠随机分为6组。通过测定血清转化生长因子β 1（TGF-β 1）和血管内皮生长因子（VEGF）水平，评价部分纯化蛋白和LMWH的抗肿瘤作用。此外，肿瘤体积，中位生存时间（MST），和总脂质，DNA和RNA在肝组织，肝功能检查和氧化还原状态进行了估计。与对照组相比，肿瘤小鼠的血清TGF-β1VEGF水平显著升高（p<0.005），并在用LMWH和纯化蛋白治疗后恢复至其正常水平（p<0.005）。&此外，与对照组相比，肿瘤化组中谷胱甘肽（GSH）的巨噬细胞含量显著降低（p<0.005），并且在LMWH和纯化蛋白处理后显著增加（p<0.05）。荷瘤小鼠的中位生存期为12.25± 2.5天，纯化酶和LMWH治疗组的中位生存期分别为19.00± 4.69和15.75± 4.11天，生存延长率分别为155.1%和128.6%。结果表明，从红毛菊根中提取的部分纯化蛋白具有较高的生物活性。sativus和LMWH对瑞士白化小鼠中的EAC细胞具有抗血管生成活性。版权所有2014年，曼苏拉大学。制作和主办Elsevier B.V.所有权利reserved.*通讯作者。联系电话：201097400781。电子邮件地址：lailaeissa2002@yahoo.com（洛杉矶）Eissa）。曼苏拉大学http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbas.2014.05.0022314- 808 X/版权所有2014年，曼苏拉大学。制作和主办Elsevier B.V.保留所有权利。eGYPTI anJOURNALofbasI cand aPPlI e dSCIENCES 1（ 2014）88e96891.介绍氧化应激是由活性氧的产生与生物系统容易地对活性中间体解毒或容易地修复所产生的损伤的能力DNA链的氧化损伤，随后基因表达的突变和改变是ROS促进癌发生的主要机制抑制原发性肿瘤的生长，而是防止癌症通过转移而扩散。因此，本研究的目的是研究SOD样活性酶（部分纯化的天然蛋白质）的抗肿瘤和抗转移作用。sativa）与低分子量肝素（速碧林，MW 4.5KDa）相比。[1]的文件。因此，超氧化物的保护和有益作用在临床前和临床上，已经证明SOD在对抗广泛的疾病，包括缺血-再灌注损伤、炎症和癌症中起作用[2]。细胞通常能够通过使用酶如SOD和过氧化氢酶来保护自己免受ROS损伤SOD存在于原核生物和真核生物中，它们催化超氧阴离子自由基（O.2-）在细胞过程中解毒活性氧[3]。超氧化物歧化酶（SOD）是一种催化O.2-氧和过氧化氢，大约在40年前被发现。SOD可能是最有效的抗ROS药物，最初被认为是一种理想的药物。在人类中存在三种SOD酶，SOD 1是细胞质Cu/Zn-SOD，SOD 2是线粒体Mn-SOD，SOD 3是细胞外Cu/ZnSOD。许多研究报道了从动物血液和植物如西瓜、豌豆、大蒜和珍珠粟中纯化Mn-SOD[4]。通过添加这些外源性分离的 Mn-SOD抑 制 肿 瘤 细 胞 [4] 。 锰 超 氧 化 物 歧 化 酶（Mn-SOD）是负责防御线粒体中ROS引起的氧化损伤的主要酶之一[5]。萝卜Raphnussativus（R. sativus）是一年生草本植物，作为蔬菜食用。它属于植物科。它已被用于民间医药作为一种天然药物对许多有毒物质。降低糖尿病大鼠的血糖水平[6]，改善高脂饮食大鼠结肠粘膜的组织病理学[7]。最近，Habib和Othman报道了来自萝卜的SOD上调糖尿病患者的红细胞葡萄糖摄取[8]。萝卜提取物改善雄性小鼠的抗氧化状态，可以克服或至少显着减少霉菌毒素（玉米赤霉烯酮）的影响[9]。肝素和低分子量肝素（LMWH）通常用于预防或治疗癌症患者的血栓栓塞并发症[10]。根据早期观察结果，肝素抗凝治疗可改善癌症患者的生存率，因此启动了几项前瞻性临床试验，旨在测试肝素作为潜在抗癌治疗的可能性[11]。肝素的临床前分析提供了其在各种动物模型中抗转移活性的证据[12]。肝素是一类称为糖胺聚糖的酸性多糖的成员，由糖醛酸和己糖胺的交替残基共价结合至丝甘蛋白核心蛋白的丝氨酸残基组成[13]。此外，还研究了不同低分子量肝素（LMWH）的肿瘤抑制作用[14]。来自各种动物模型的实验证据一致支持肝素减弱转移的能力。此外，这种保护作用并不是一种2.材料方法&2.1.制备R.大蒜提取物约300 g的根组织。 用1L冰冷的tris缓冲液pH7匀浆。所得上清液用80%硫酸铵沉淀，沉淀的蛋白质通过磷酸钙凝胶，然后用系列浓度的NaCl溶液洗脱。用0.4和0.8 M盐水溶液洗脱后的蛋白质用蒸馏水透析，然后用聚乙二醇浓缩。将浓缩的部分纯化的酶用Tris缓冲液复溶并施加到SephadexG100柱上。按Lowry等的方法测定纯化蛋白的浓度和SOD活性。[15]DeChatelet etet al.[16]分别。2.2.纯化酶的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSe PAGE）将蛋白质样品与20ml SDSe PAGE上样缓冲液（250 mMTrise HCl，10%SDS，0.5%溴酚蓝，50%甘油pH 6.8），并在100° C下孵育5分钟。样品上样于10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上凝胶用考马斯蓝染色，并目视检查蛋白条带[17]。2.3.动物和肿瘤细胞系所有实验均在成年雌性瑞士白化小鼠上进行，所述小鼠 购 自 Theodore Bilharz Research Institute ， Giza ，Egypt，平均体重为25克至30克。将小鼠圈养在钢网笼中（10只小鼠/笼），并在商业标准饮食和自来水中保持两周的适应期。根据以下方案，将小鼠随机分为6组（每组10只I组：正常小鼠生理盐水处理组（对照）：每只小鼠每天腹腔注射生理盐水溶液200ml，持续10天。组II：用纯化的SOD处理的正常小鼠：用每日剂量为200 ml纯化蛋白质（4 mg/kg BW/天）的腹膜内处理健康小鼠10天[18]。组III：用低分子量肝素（LMWH）处理的正常：用每日剂量的LMWH（速碧林，平均分子量）腹膜内处理健康小鼠10天。4.5kDa）得自GlaxoSmithKline（Brentford，Middlesex，UK）（1000 IU/Kg/BW/天[19]），200ml。组IV：盐水处理的荷EAC小鼠：每只小鼠腹膜内注射1 XIO6个肿瘤细胞一次。后90eGYPTI anjournalofbasI cand aPPlI edSCI en nces 1（ 2014）88e96肿瘤接种24小时后，每天向小鼠腹膜内注射200 ml生理盐水溶液，持续10天。V组：用纯化的SOD处理的荷EAC小鼠：每只小鼠腹腔内接种1 × 106个肿瘤细胞，24小时后用每日剂量（200ml）的纯化蛋白（4 mg/kg BW/天）腹腔内处理10天。第VI组：低分子肝素处理的EAC荷瘤小鼠：每只小鼠腹腔内接种1 × 106个肿瘤细胞，24 h后腹腔内给予每日剂量的LMWH（速碧林）（1000 IU/Kg/BW/天），持续10天。2.4.样品末次给药后第1天，每组处死10只小鼠，其余5只小鼠用于中位生存时间测定。&收集含有EAC细胞的腹水并测量其体积。快速解剖肝脏样品，用等渗盐水冲洗并干燥。0.25将10 g这些组织在冰冷盐水中均质化，并稀释至5%（w/v）。将上清液用于生化分析。还通过心脏穿刺从深度乙醚麻醉的小鼠收集血液样品，并将其血清用于亚稳态分析。2.5.纯化酶的SOD样活性通过DeChatelet等人的方法测定不同浓度纯化蛋白的SOD样活性[20]。2.6.EAC细胞体外通过Maclimans等人的方法，使用台盼蓝排除法测定细胞毒性[26]第10段。用纯化的蛋白质和LMWH处理后，将0.2ml的0.32%台盼蓝与0.2ml的EAC细胞混合，并在37℃下孵育10分钟。在孵育后5分钟内，使用同型细胞计数器对活肿瘤细胞（未染色细胞）的数量进行计数2.7.中位生存时间（MST）和寿命延长（ILS %）采用Gupta等人的方法，通过记录寿命增加百分比和中位生存时间[21]第20段。2.8.生化试验图1 eSDS-PAGE用于萝卜提取物（泳道1）和预染色的宽范围蛋白质标记物（标记物）和标准SOD-酶（泳道2）。Doumas[27].通过Beutler等人的方法测定红细胞还原型谷胱甘肽（GSH）含量[28]。采用Stocks和Donnandy的方法测 定 血 液 中 的 丙 二 醛 （ MDA ） 水 平 [29] 。 采 用DeChatelet等人[30]的方法测定血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性。采用El-Aaser和EL-Merzabani描述的方法测定血清碱性磷酸酶（ALK-P）活性[31]。通过Szasz等人的方法测定血清γ-谷氨酰转移酶（g-GT）活性[32]。通 过 Berkels 等 人 [33] 的 方 法 ， 使 用 市 售 测 定 试 剂 盒（ Egyptian American Company for laboratory services ，Egypt）估计血清中的一氧化氮（NO）活性。TGF-β1用市售的ELISA试剂盒（SigmaAldrich，USA）测定.按照 制 造 商 的 指 导 使 用 市 售 的 测 定 ELISA 试 剂 盒（SigmaAldrich，USA）测定VEGF2.9.统计分析使 用 Instate 软 件 计 算 机 程 序 版 本 2.03 （ Graph pad ，USA）对结果进行统计分析。使用单尾p值表进行统计分析。当相应的概率水平（p）分别≤0.05和≤0.005时，差异被认为具有显著性和高度显著性。相关系数（r）用于衡量两个变量之间的关系。相关性在r^0.50处弱，在r^0.50e 0.75处中等，在r^0.80e 1.00处强根据Schneider的方法[22]，从肝匀浆中提取。用Dische和Schwatez[23]并通过Mejbaum方法[24]描述的苔黑酚程序测量RNA含量。通过Knight等人的方法测定肝组织中的总脂质[25]。采用Reitman和Frankel方法比色测定血清丙氨酸转氨酶（ALT）[26]。血清白蛋白浓度测定方法：3.结果R. Sativa提取物显示蛋白质浓度为52.5mg/ 100 ml提取物，在R.如图5所示，检测到预期的分子量为25 KDa的Mn-sod酶[5]。1.一、体外研究表明，部分纯化的蛋白具有SOD样活性，其活性随浓度的增加而增加eGYPTI anjournalofbasI cand aPPlI e dSCIENCES 1（ 2014）88e9691表1e部分纯化的蛋白质（52.2 mg蛋白质/100 mL）和LMWH（IU）对EAC细胞的体外SOD样活性和细胞毒性浓（毫升/毫克）SOD（%抑制）SOD的细胞毒性%LMWH的细胞毒性%50mL/mg百分之六十九点四百分之七十点六百分之五十一点五100mL/mg百分之八十九点八85.0%百分之六十七点二150mL/mg百分之九十六点二百分之九十八点八79.0%200mL/mg百分之九十八百分之九十九点一百分之八十六点八浓度为200mL/mg时，抑制率达到98%。此外，测试了该蛋白和LMWH对活EAC细胞的细胞毒性。死亡细胞的百分比随着酶和LMWH浓度的增加而增加，分别达到99%和86%（表1）。与相应的对照组（组I）相比，未给药EAC荷瘤小鼠（组IV）肝组织中的DNA和RNA含量显著升高（p<但与对照组相比，同一组肝组织中总脂含量极显著降低（ p0.005 ） << 在 用 部 分 纯 化的SOD样 活 性 蛋 白 和LMWH（V组和VI组）处理后，这些参数恢复到正常水平（p0.005）（图11）。2）。在表2中，与正常和未处理的肿瘤组（I、II、III和IV）相比，处理的小鼠（组V和VI）的血清中的SOD活性非常显著地（p<然而，与相应对照组相比，未处理EAC荷瘤动物（组IV）的血清中一氧化氮 （ NO ） 水 平 和 RBC 中 MDA 水 平 高 度 显 著 升 高（ p0.005 ） ， 而 红 细 胞 GSH 含 量 高 度 显 著 降 低（p<

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