肿瘤诊断与治疗新技术：三维平台对癌细胞分离的影响 – W.G. 张正云 Liu，S.W. 彭世荣

工程7（2021）1424研究肿瘤诊断和治疗新技术-文章三维平台刚度和分层尺寸对癌细胞分离的影响W.G. 张正云Liu，S.W.彭世荣香港城市大学电机工程系，生物系统、神经科学和纳米技术中心，香港999077，中国阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2020年2020年7月23日修订2020年9月1日接受2020年11月5日网上发售保留字：细胞分离细胞迁移鼻咽癌（NPC）三维支架平台A B S T R A C T癌细胞分离对于癌症诊断和治疗是高度期望的除了生物化学方法外，工程平台是基于癌细胞响应周围微环境物理变化的独特特性从正常细胞中分选癌细胞的有效替代方案。 在这项工作中，开发了三维（3D）仿生支架平台，以基于精确控制的设计参数（包括刚度、层数和结构布局）将鼻咽癌43（NPC 43）细胞与永生化鼻咽上皮460（NP 460）细胞分离。NPC 43和NP 460细胞在支架平台上的迁移特性显示，NPC 43细胞可以挤入10μ m宽、15μ m深的沟槽中，而NP 460细胞不能。不同的迁移行为主要是由于细胞与周围微环境的相互作用不同。NPC 43细胞具有丝状伪足样突起，而NP 460细胞表现出片状形态。使用这些3D仿生平台，在具有40/10lm脊/沟（R/T）的在顶层上的光栅和在底层上的20/10 lm R/T网格此外，分离效率通过加入活性条件培养基（ACM）使细胞具有更高的运动性和变形性，进一步增加到93%。这些结果证明了应用具有适当设计的仿生工程平台将癌细胞与正常细胞分离以用于潜在癌症诊断和治疗的能力。©2020 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍肿瘤是由充满癌细胞和非癌基质细胞的细胞外基质（ECM）组成的复杂异质组织。不同种类的基质细胞，包括成纤维细胞、免疫细胞、巨噬细胞和内皮细胞，与周围的癌细胞共同占据并相互作用[1从异质细胞群中分离癌细胞的能力在癌症诊断、监测和治疗中将是期望的生物标志物通常用于识别不同的细胞类型;例如，互补荧光团缀合的抗体与靶细胞结合，使得靶细胞可以通过荧光检测器识别[6或者，通过将抗体缀合的磁珠与感兴趣的细胞上的特异性蛋白质结合，可以通过经由施加的外部磁场在珠上施加磁力来分选标记的细胞[10*通讯作者。电子邮件地址：pang@cityu.edu.hk（S.W. Pang）。还手动挑选细胞用于单细胞分离[14显微操作器和微量移液器可用于在倒置显微镜下拾取特定细胞。此外，微流体系统已经被开发用于细胞分选，并且具有精确流量控制、设备最小化和低样品消耗的优点[17除了生物标志物之外，包括细胞大小[21例如，微流体系统中的漏斗形微结构用于阻挡较大或更刚性的细胞，而较小或更易变形的细胞可以在振荡流下通过[34，35]。虽然细胞可以高效分离[36]，但它们通常需要外部设置或力量，如生物标志物，抗体，磁场或微流体流动，这使得该过程更加复杂和昂贵。除了利用外部生物化学试剂或外部磁力或微流体力来分离细胞的方法之外，其他方法也可以用于分离细胞。https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.09.0102095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可从ScienceDirect获取目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engW.G. 张正云Liu和S.W.庞工程7（2021）14241425··×·×··× ×·这些方法利用了设计的平台上的细胞相互作用行为之前，我们的团队研究了一种单层平台，该平台具有用于细胞迁移和分离的不同设计[37，38]。虽然发现单层平台在为细胞迁移提供引导方面是有效的，但它们不能将癌细胞与正常细胞分离。因此，开发了三维（3D）平台以提供细胞分离的能力。3D平台还提供了ECM在现实生活中的更好表示，因为ECM在现实生活中是3D的。结合3D平台中的微流体通道，可以单独收集分离的细胞用于进一步研究。因此，在这项研究中，重点是通过使用可控的3D支架平台将鼻咽癌（NPC）细胞与鼻咽上皮（NP）细胞分离。NPC被认为是一种高度侵袭性和转移性的癌症，患者在早期通常不会表现出明显的症状[39与其他类型的癌症不同，NPC与EB病毒（EBV）密切相关。然而，当NPC细胞在体外培养时，EBV附加体经常减少[42，43]。最近，成功建立了一系列稳定的NPC细胞系[44]。因此，重要的是进行NPC细胞的迁移行为的体外研究，并开发用于癌细胞分离的平台，而无需化学添加物或外力。在这项工作中，三维脚手架平台的设计和开发，希望利用固有的独特NPC细胞形态、迁移特征和与周围微环境的不同相互作用，以便将NPC 43细胞与永生化NP 460细胞分离。由于NP 460和NPC 43细胞的尺寸约为15μm，当它们在具有10μ m宽和15μ m深的沟槽的单层格栅平台上培养时，这些细胞几乎不能挤进10μ m宽的沟槽中，因为沟槽宽度比细胞尺寸窄。因此，通过设计具有不同尺寸、布局和尺寸的3D脚手架平台材料特性，具有相似尺寸的NP 460和NPC 43细胞可以基于它们是否可以迁移到窄沟槽中而被分离在适当的平台刚度、多层布局和层尺寸的情况下，NPC 43电池有85%的可能性挤进10μ m宽的沟槽中，而NP 460电池只有10%的可能性在窄沟槽中。此外，当NPC 43细胞由于受到活性条件培养基（ACM）的刺激而具有更高的运动性时，它们表现出很高的可能性挤进10μ m宽的沟槽中，从而导致更高的细胞分离效率。2. 材料和方法2.1. 工程脚手架平台制作用生物相容性弹性体聚二甲基硅氧烷（PDMS）制造单层和双层支架平台。如前所述，通过复制模塑技术形成单层平台[37，38]。双层平台的工艺流程如图1所示;这包括分别制造顶层和底层，并在用氧（O2）等离子体处理各层后通过反向压印将两层堆叠在一起。底层以与单层支架平台相同的方式制备，如图1所示。 1（a）.在硅光栅模具上涂覆防粘层后，的三氯（1H，1H，2 H，2 H-全氟辛基）硅烷（FOTS），将PDMS混合物浇铸在模具上并在80 °C下在热板上固化6小时。通过使用不同的预聚物基料和固化剂（Dow CorningSylgard 184试剂盒，USA）以5：1、10：1和30：1（w/w）的三种混合比来改变PDMS的刚度。使用纳米压头（Hysitron TI 700Ubi，USA）表征刚度顶层是通过反向压印法制备的，PDMS层采用涂覆有FOTS（表面能：（71 ± 3）mN·m-1）的Si光栅模具和涂覆有3-甲基丙烯酰氧基丙基三氯硅烷（MOPTS）和FOTS（表面能：（23 ±3）mN·m-1）的4：1质量混合物的另一抗堆叠层的Si衬底。然后用氧气等离子体处理顶层和底层，氧气流速为20sccm（1 sccm = 1 cm 3 min-1），腔室压力为80 mTorr（1毫托=0.133帕）和60瓦的射频（RF）功率。两个光栅层通过彼此垂直地堆叠而结合在一起。在80 °C下烘烤10分钟后，将双层支架平台从Si衬底剥离。2.2. 细胞培养NP460和NPC43细胞均来自S. W. Tsao团队由Lin等人开发[44]。使用完全补充有1%EpiLife限定生长补充剂（EDGS; Gibco）的EpiLife培养基（Gibco，USA）和完全补充有0.2%限定角质细胞生长补充剂（Gibco）的限定角质细胞-无血清培养基（1 ; Gibco）的1：1混合物在培养基中培养NP 460细胞。将NPC 43细胞维持在具有10%胎牛血清（FBS）和0.2%牛血清（FBS）的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基（1 ; Gibco）中。2 mmol L-1岩石抑制剂Y-27632（25 mg; ENZO，Switzerland）。将NP 460和NPC 43细胞培养基与1%抗生素抗霉菌剂（Gibco; 100单位（U）/毫升青霉素G钠、100 mg mL-1链霉素和0.25 mg mL-1链霉素B）混合以避免污染。每两天更换培养基，每五天传代细胞2.3. 时间推移和免疫荧光成像将3D支架平台结合在35 mm玻璃底共聚焦皿上用于成像。在细胞接种之前，将平台用O2等离子体处理1分钟， O2流速为20sccm、80 mTorr的室压和60 W的RF功率，以产生亲水性表面，从而增强细胞在平台上的附着细胞表面处理后，立即以7.0 × 104和1.1× 105cells mL-1的密度，以2 mL的体积分别接种于单层和双层平台上，并置于培养箱中培养6 h。之后，将培养基更换为细胞培养基和二氧化碳（CO2）非依赖性培养基18045-然后使用Nikon EclipseNi-E直立电动显微镜（日本）每隔一周拍摄一次延时图像。5 min，15 h。活细胞免疫荧光图像由具有异硫氰酸荧光素和四乙基罗丹明异硫氰酸盐成像功能的同一显微镜捕获。2.4. 数据分析细胞迁移速度和轨迹由美国国立卫生研究院（NIH）ImageJ（版本1.50i; USA）与手动跟踪插件（USA）一起跟踪。在圈出细胞形状后，通过ImageJ中的测量功能完成细胞形态分析;并计算细胞面积、周长和椭圆拟合的长轴和短轴。在延时成像期间死亡、分裂或与其他细胞接触的细胞从分析中排除。W.G. 张正云Liu和S.W.庞工程7（2021）14241426p×½2C=×图1.一、制作一个双层平台。（a）涂覆有FOTS的Si模具，用于在PDMS上进行图案复制（b）涂覆有混合硅烷的Si晶片，其具有通过压印形成的图案化PDMS(c)两层平台由两层图案化的PDMS在O2等离子体处理后堆叠在一起形成。(d)制造的双层平台的显微照片。FOTS：三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷; MOPTS：3-甲基丙烯酰氧基丙基三氯硅烷。细胞圆度（R）计算如下：R¼A其中A是投影面积，C是单元的周长ð1Þ在这项工作中，一层光栅平台与沟槽10l m宽，15l m深，用于调查的影响，平台的形式刚度的概率的NP 460和NPC 43细胞挤压到狭窄的沟槽。细胞挤压的概率为了计算单元形状的纵横比，在具有短轴a和长轴b的单元上叠加椭圆，使得通过b/a获得纵横比。使用单因素方差分析（ANOVA）检验分析组间的统计学差异，显著性水平为p0.05。所有结果均表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）。细胞分离效率通过使用顶层沟槽或底部网格中的NPC 43细胞的概率除以该特定位置中的NPC 43和NP 460细胞的概率来定义。2.5. 扫描电子显微镜将平台上的细胞用10磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗两次用4%多聚甲醛固定15 min，然后将乙醇浓度从30%、50%、70%、80%、90%、95%逐渐增加到100%进行细胞脱水;然后将细胞在临界点干燥器中保持3小时。然后将干燥的样品用Au薄层涂覆以避免带电，并置于扫描电子显微镜SU5000（Hitachi，Japan）中进行成像。3. 结果和讨论3.1. 单层平台3.1.1. 平台刚度基质硬度已被证明会影响细胞行为，如迁移速度、形态和增殖[45进入10μ m宽的沟槽中的单元数被定义为窄沟槽除以总细胞数。从统计分析中排除已分裂、死亡或与其他细胞接触的细胞，以避免由于细胞状态变化而产生的其他影响。通过不同的PDMS基料：试剂混合比获得不同的平台刚度。图2（a）所示的测量杨氏将NP 460和NPC 43细胞分别接种在平台上，然后孵育6小时，随后进行15小时的延时成像。图2（b）显示几乎没有NP 460细胞可以挤进10μ m宽的沟槽中，而不管平台的刚度如何，而23%的NPC 43细胞被发现在较硬平台上的窄沟槽中。在较硬的平台上，NPC43细胞可与NP460细胞分离。图2（b）中所示的结果表明，使用30：1的PDMS基质：试剂混合比制造的较软平台不能用于将NPC 43细胞与NP 460细胞分离。因此，选择使用5：1和10：1的PDMS基料：试剂混合比制造的相对较硬的平台用于进一步研究和表征。图中的显微照片。图2（c）显示了在PDMS基质：试剂混合比为5：1和10：1的平台上NP 460和NPC43细胞的不同形态。通常，NP 460细胞具有在所有方向上扩散的较大细胞体另一方面，NPC 43细胞较小;它们在较硬的平台上沿着光栅方向对齐，但在较软的平台上更圆。 计算细胞圆度并显示在图2（d）中，圆度为1。NP460细胞圆度对平台刚度没有显著依赖性，而NPC43细胞在更硬的平台上变得更细长W.G. 张正云Liu和S.W.庞工程7（2021）14241427图二、（a）测量的具有不同基料：试剂混合比的PDMS的杨氏（b）NP 460和NPC 43细胞迁移到具有不同刚度的单层平台上的10μ m宽的沟槽中的概率（误差条在1%内）。（c）在具有不同刚度的单层平台上的NP 460和NPC 43细胞的显微照片和（d）细胞形态战壕宽10米，深15米细胞数（N）> 20。R/T：脊/沟; NS：不显著。* ：p0.001。并且可以具有更高的可能性挤进狭窄的沟槽中。3.1.2. 图案形状和布局细胞在紧密开口中的接触面积可以决定细胞迁移的路径、方向或细胞形状的变形。因此，如图3（a）示意性所示，创建了具有相同开口面积的四种不同孔形状（包括圆形、六边形、正方形和三角形）的单层平台，以检查NPC 43细胞如何在具有不同形状的孔周围移动。15l m深的圆形孔的直径为18l m，这大致等于细胞大小;因此，所有四种形状都设计为具有约256l m2的相同面积。细胞接种7 h后，细胞仍呈圆形，不能完全填充整个孔。因此，孔填充程度（其通过将孔面积除以孔面积来定义）用于量化孔中孔尺寸 如图如图3（a）所示，NPC 43细胞最初在不同形状的孔中具有不同程度的填充，但在22小时后最终可以填充不同形状的整个孔。这表明NPC 43细胞可以伸展它们的身体以填充不同形状的紧密开口由于上述性质，单层平台上的图案从格栅修改为网格，使得在网格交叉点处形成更多的接触面积，这可以允许更多的NPC 43细胞进入10μ m宽的沟槽中用于细胞分离。NPC43细胞在单层平台上的迁移轨迹如图所示。 3（b）款。该图显示，格栅图案引导细胞沿着其具有更细长形态的方向迁移，而网格图案将细胞定位在具有更圆形态的交叉点处NPC43细胞挤入10 μ m宽沟槽的可能性在具有网格的平台上更高，如图所示。 3（c），这意味着更高的分离度利用底层上的网格设计实现了NP460电池的NPC43电池的效率3.2. 双层平台3.2.1. 平台刚度开发了用于细胞分离的多层3D平台，如图4（a）所示。双层支架平台用于模拟组织中的ECM，其由3D微环境组成，以使细胞能够迁移。顶层和底层上的图案的尺寸为40/10μ m的脊/沟（R/T）光栅，其为15l m深。如图如图4（a）所示，NP 460和NCP 43细胞在平台上具有不同的形态。NP460细胞为片状片状伪足，胞体呈伸展状。相比之下，NPC43细胞延伸出丝状伪足样突起，具有细长的细胞体，以与周围的微环境相互作用，这使得细胞更容易挤进10μ m宽的沟槽中。这些细胞形态代表了在相同条件下三次独立运行后通过扫描电子显微镜成像的主要细胞（每种类型超过30个图4（b）显示在两层平台上，NP460细胞具有10%的概率挤进10μ m宽的沟槽中，这在单层平台上是不可能的另一方面，NPC43细胞具有更高的可能性挤进狭窄的沟槽中，为70%。在具有5：1和10：1的PDMS基质：试剂混合比的双层支架平台上研究了平台刚度的影响 如图如图4（b）所示，不同的平台刚度对NP 460细胞的概率几乎没有影响，但是对于更硬的平台上的NPC 43细胞，概率高4%。NP 460和NPC 43细胞的分离与它们在图案化平台上的不同细胞形态有关。NPC43细胞挤入10μ m宽W.G. 张正云Liu和S.W.庞工程7（2021）14241428图3.第三章。（a）NPC 43细胞在15μ m深的具有不同形状但相同面积的孔中的填充程度（b）迁移轨迹和（c）NPC 43细胞迁移到具有40/10μ m R/T光栅和网格的10μ m宽沟槽中的概率沟槽深度为15μ m，PDMS基料：试剂混合比为5：1。见图4。(a)顶部脊上的NP 460细胞和顶部沟槽中的NPC 43细胞在具有40/10lmR/T的顶层和底层的双层支架平台上的显微照片（代表来自三次独立运行的每种类型的超过30个细胞）。(b)NP 460和NPC 43细胞在具有不同刚度的双层支架平台上的10μm宽的顶部沟槽中的概率（误差条在1%内）。每层的厚度为15μ m。当使用具有40/10μ m R/T光栅的双层支架平台时，在5：1的PDMS基质：试剂混合比下，沟槽比NP 460细胞高64%3.2.2. 底层结构的影响为了进一步提高细胞分离效率，将底层图案从格栅改变为网格，W.G. 张正云Liu和S.W.庞工程7（2021）14241429×·×·如图5（a）所示，顶层光栅垂直于底层放置。由于网格图案在交叉点处提供了更多的接触面积，更多的NPC 43细胞可以进入窄沟。该平台由5：1的PDMS基质：试剂混合比制成，在顶层上具有40/10 lm R/T光栅，并且在顶层上具有40底层40/10l m R/T光栅或网格，均为15l m深 图图5（b）示出了将底层图案从格栅改变为网格对NP 460细胞没有影响，但是导致NPC 43细胞挤入10 μ m宽的沟槽的概率增加了3%网格图案不仅提供了更多的接触面积，交叉处，而且还允许NPC 43细胞的更多丝状伪足样突起与底层上的沟槽接触，这导致更多的NPC 43细胞挤压到10μ m宽的沟槽中。为了研究细胞与底层沟槽接触对NP 460和NPC 43细胞分离的影响，制造了双层支架平台，其在顶层上具有40/10μm R/T光栅，并且底层脊的宽度从10、20、40、80增加到160μ图第6（a）段。10μm宽的底层沟槽之间的逐渐增加的距离图图6（b）示出NPC 43细胞挤入窄沟槽的概率随着脊宽度的增加而降低，这很可能是由于细胞与底层的接触减少战壕在具有20/10和40/10 lmR/T的底层网格的双层支架平台上的NPC43细胞的显微照片显示在图1B中。 6（c）. 当脊宽度较大时，10μm宽的沟槽之间的间隔也较大，并且NPC 43单元必须延伸较长的突起以到达底层中的沟槽。 图图6（d）示出了在底部网格较密的情况下，NP 460细胞进入窄沟槽的概率几乎没有差异，而NPC 43细胞挤入10 μ m宽沟槽的概率增加了8%。细胞极化形状通过将细胞拟合到细胞极化模型中来量化。椭圆及其长轴和短轴的测量。通常，更细长的单元形状可以适合更窄的沟槽。在具有20/10lmR/T的底层网格的双层支架平台上的NP 460和NPC 43细胞的短轴长度在图1B中进行了比较。 6（e）. 该图显示，NP 460细胞在平台上更分散，平均短轴长度为22μ m，而NPC 43细胞更细长，平均短轴长度减少为12μ m。形状越长，与NP 460细胞的尺寸相比，NPC 43细胞的较小尺寸可能使它们更容易挤进3D平台中的10μm宽的沟槽中;因此，当在底层中使用20/10μ m R/T网格图案时，与NP 460细胞相比，NPC 43细胞挤进10μ3.3. 在双层支架平台上共培养的NP 460和NPC 43细胞到目前为止，NP 460和NPC 43细胞分离概率是基于在平台上分别接种两种细胞。接着，将NP 460和NPC 43细胞在优化的双层支架平台上共培养，在底层上具有20/10lmR/T网格用不同颜色的荧光蛋白转染NP 460和NPC 43细胞，使得它们可以在荧光成像下区分;NP 460细胞为绿色，NPC 43细胞为红色。如上所述，从分析中排除分裂、死亡或与其他细胞接触的细胞因此，本研究中的最佳细胞密度为1.1 × 105 cells mL-1当共培养NP460和NPC 43细胞时，对于每个细胞使用相同的细胞密度总细胞密度为2.2 × 105个细胞mL-1，与早期鼻咽癌肿瘤的可用细胞数相比要低得多[49]。因此，所提出的平台可用于NPC 43细胞密度较低时的NPC早期诊断。该平台还可以通过使用具有更大面积的平台来按比例放大以分离大量细胞图7（a）示出了在双层平台上共培养的NP 460和NPC 43细胞的荧光和明场图像，在底层上具有20/10和40/10lm R/T网格。在培养箱中培养细胞6小时后，拍摄活体荧光图像，然后在亮视野下连续细胞成像15小时。图7（b）显示NP 460和NPC 43细胞分别具有10%和84%的概率挤入具有20/10μ m R/T网格的双层支架平台上的10μm宽的沟槽中。因此，当NP 460和NPC 43细胞在这样的平台上共培养时，获得74%的分离概率。更密集的20/10lm R/T网格对于细胞分离更有效，因为与更密集的20/10 lm R/T网格相比，NPC 43细胞具有84%的高概率到达窄沟槽。图五、（a）底层有40/10l m R/T光栅和网格的双层平台的显微照片（b）NP 460和NPC 43细胞到达在底层上具有40/10μ m R/T光栅和栅格的双层平台上的10μ m宽沟槽的概率（误差条在1%内）。每层的深度为15μ m，PDMS基料：试剂的混合比为5：1。W.G. 张正云Liu和S.W.庞工程7（2021）14241430见图6。(a)显微照片和（b）NPC 43细胞在双层平台上的概率，底层脊宽为10，20，40，80和160μ m。所有的战壕都是10米宽。（c）具有延伸的突起以到达双层平台上的底层网格沟槽的NPC 43电池的显微照片（d）NP 460和NPC 43细胞到达在底层上具有20/10和40/10μ m R/T网格的双层平台上的10μ m宽的顶部沟槽的概率（误差条在1%内）。（e）在底层具有20/10lmR/T网格的双层平台上的NP 460和NPC 43电池的短轴长度每层的厚度为15μ m，PDMS基质：试剂混合比为5：1（N> 30; *：p <0.001）。在底层具有40/10l m R/T网格的平台上，概率较低，为73%分离后，NPC 43细胞可以保存并通过底部附近的微流体平台中的出口收集，而NP 460细胞可以通过顶层上的另一个出口引导或者，激光显微切割技术[50]可用于精确切割平台的顶部并将平台分成两半。分离后，可从上半部分收获NP 460细胞，可以从平台的下半部分收集NPC 43细胞。3.4. 鼻咽癌细胞运动性对细胞分离的影响NPC 43细胞的运动性可以影响3D ECM中的细胞运动，因为癌细胞在肿瘤进展期间通常具有不同的运动性[51从成纤维细胞的外来体获得的ACM已经显示出增强成纤维细胞的运动性和转移性。W.G. 张正云Liu和S.W.庞工程7（2021）14241431图7.第一次会议。（a）在双层平台上共培养的NP 460和NPC 43细胞的双视野和荧光显微照片，在底层上具有20/10μ m R/T网格用绿色荧光蛋白转染NP460细胞，用红色荧光蛋白转染NPC43细胞（b）在底层具有20/10和40/10μ m R/T网格的双层平台上共培养的NP 460和NPC 43细胞的分离概率（误差条在1%内）。每层的厚度为15μ m，PDMS基料：试剂的混合比为5：1。某些癌细胞[54，55]。在本研究中，将ACM加入到NPC 43细胞的培养基中，以检查运动的变化及其对NPC 43细胞与NP 460细胞分离效率的影响。当NPC 43细胞培养液与ACM以1：1的体积比混合时，NPC 43细胞在40/10lmR/T的单层平台上的迁移速度更快，如图8（a）所示;这证明ACM可以增强NPC 43细胞的运动性。已经表明，ACM中所含的外泌体的四链蛋白Cd 81可以促进通过Wnt/平面细胞极性信号传导的癌细胞运动性[54]。在加入ACM后，随着时间的推移监测单元形状的变化，如单元纵横比所示，因为在单元形状改变后，单元具有不同的进入窄沟槽的概率 如图如图8（b）所示，用ACM培养的NPC 43细胞显示出更大的纵横比，并且在具有40/10 lm R/T和5：1 PDMS基质：试剂混合比的单层平台上更长。图8（c）示出了34%的NPC细胞能够挤进顶层上的10μm宽的沟槽中，然后进一步移动到底层网格中。因此见图8。 (a)ACM刺激的NPC 43细胞在具有10μ m宽沟槽的单层平台上的迁移速度和（b）纵横比（*：p0.001）。(c)NPC 43细胞在ACM刺激下到达双层平台上20/10l(d)在具有20/10l mR/T底部网格的双层平台每层的厚度为15μ m，PDMS基料：试剂的混合比为5：1。W.G. 张正云Liu和S.W.庞工程7（2021）14241432当用添加的ACM培养NPC 43细胞时，它们到达底层网格的概率增加了8倍以上。因此，这些结果表明，ACM有效地刺激了NPC 43细胞以改变其运动性和形态，这允许NPC 43细胞挤压通过狭窄的沟槽并移动到3D平台中的底层将具有ACM的NPC 43细胞与NP 460细胞在双层支架平台上共培养，所述支架平台在底层上具有20/10μm R/T网格和5：1的PDMS基质：试剂混合比。图中的结果。图8（d）显示当加入ACM时，NPC43细胞挤入10 μ m沟槽的概率增加5%。ACM的添加增加了NPC 43细胞的速度和细胞的伸长，使得细胞更容易移动通过10μ m宽的沟槽并进一步进入底层网格。然而，ACM的存在对NP 460细胞进入顶层沟槽或底层网格的运动几乎没有影响。因此，在培养基中添加ACM有助于在底层网格中进一步使用多层平台，对于更活跃的癌细胞，可以实现更高的细胞分离效率。4. 结论正常细胞和癌细胞之间的细胞分离在癌症诊断、治疗和药物开发中至关重要。由于难以建立稳定的EBV阳性细胞系，NPC细胞迁移行为的细节以前没有报道在这项工作中，开发了3D支架平台，以基于平台特性将NPC 43细胞与NP 460细胞分离。设计参数包括平台刚度、格栅或网格图案布局、层数和网格图案密度，用于优化平台设计以实现最高分离效率。使用两层脚手架平台，20/10l m R/T网格，底层导致在顶层10μ m宽的沟槽中NPC 43细胞与NP 460细胞的89%分离效率。当通过ACM刺激给予NPC 43细胞增强的运动性时，在底层网格中获得93%的分离概率。由于NPC细胞具有高度侵袭性和转移性，因此能够将这些癌细胞与正常细胞分离是很重要的。图8所示的结果表明，在ACM刺激后，NPC 43细胞具有更高的运动性和变形性，并且分离效率提高。基于这一原理，从具有不同运动性和变形性的正常细胞中分离其他类型的癌细胞也将是可行的。在我们之前的工作中[56]，我们证明了在具有适当拓扑设计的平台上筛选各种类型癌细胞的能力。将进行进一步的研究，以研究可用于分离其他癌细胞系的最佳平台布局和特征。致谢这项工作得到了香港城市大学生物系统、神经科学和纳米技术中心 （ CBNN ） （ 9360148 和 9380062 ） 和 香 港 大 学 教 育 资 助 局（GRF项目：11247716、11218017、11213018和11212519; CRF项目：C1013- 15 G）的支持作者感谢曹世文教授和C.M.香港大学的曾博士提供了NP460和NPC43细胞。香港城市大学Zhang教授提供的活性条件培养基。遵守道德操守准则W.G.张正云刘先生及彭世文先生声明彼等并无利益冲突或财务冲突须予披露。引用[1] GossettDR，Weaver WM，Mach AJ，Hur SC，Tse HTK，Lee W，等. 微流控系统中的无标记细胞分离和分选。Anal Bioanal Chem 2010;397（8）：3249-67.[2] 菲德勒M胎儿细胞为基础的产前诊断：现在和未来的展望。临床医学杂志2014;3（3）：972-85。[3] Blainey PC，Quake SR，解剖基因组多样性，一次一个细胞。NatMethods2014;11（1）：19-21.[4] Schor SL，Schor AM.乳腺间质的表型和遗传改变：对肿瘤进展的影响。乳腺癌研究2001;3（6）：373-9。[5] GuoKT，Schäfer R，Paul A，Gerber A，Ziemer G，Wendel HP. 利用高特异性DNA适配体从全骨髓中分离和表面固定间充质干细胞的新技术。干细胞2006;24（10）：2220-31.[6] 赵熙，陈春，蔡福胜，高定，JM，罗永华。使用高度集成的微制造荧光激活细胞分选仪（IFACS）的人哺乳动物细胞分选。Lab Chip2010;10（12）：1567-73.[7] [10] J. 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