大豆黄酮与β-乳球蛋白的抗氧化及抗癌作用

医学信息学解锁25（2021）100643探讨了中药复方的理化、抗氧化、抗癌作用β-乳球蛋白对膳食黄酮大豆黄酮的影响Elham Sattarinezhada，Najmeh Fani a，*，Abdol-Khalegh Bordbara，Parisa Hatami a，Abolghasem Abbasi Kajania，Mahmood Taki ba伊斯法罕大学化学系，伊斯法罕，81746-73441，伊朗b伊斯法罕理工大学化学系，伊斯法罕，84156-83111，伊朗A R T I C L EI N FO保留字：大豆黄酮β-乳球蛋白抗氧化抗癌活性多光谱方法分子动力学模拟A B S T R A C T本文采用光谱分析、电化学分析、分子对接和分子动力学模拟等方法，研究了大豆黄酮与两种β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）结合的分子性质、抗氧化和抗癌作用。结果表明，氢键和范德华力在形成稳定配合物中起主要作用。通过分子对接和竞争性分析，推测大豆苷元与β-LG的外表面结合具有合适的结合能。分子动力学的结果表明，大豆苷元的结合降低了结合位点关键残基的灵活性，形成了一个相对稳定的复合物。就βLG的掩蔽作用而言，低浓度的β LG-大豆苷元复合物具有最佳的抗氧化活性。50μ M β LG与大豆苷元混合物作用48 h后，配合物对HeLa和MCF-7细胞的最大杀伤率分别为38.62%和47.08%。大豆苷元与β-LG络合后，其溶解性、抗癌活性及光、热稳定性均得到改善，这为食品和医药工业提供了一条有益的途径。1. 介绍香精是在各种蔬菜和食物中发现的含苯基的化学物质，包括;水果，坚果，浆果，种子，花，树皮和饮料[1，2]。在这些物质中发现了广泛的生物学特性，例如抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏、抗雌激素、抗高血糖和抗癌作用[3黄烷醇可根据其结构和不饱和度和氧化度分为不同的亚类。大豆黄酮（7-羟基-3-（4-羟基苯基）色酮）是一种可在三叶草、蓝草、大豆和大豆衍生产品中发现的黄酮类化合物[8]。关于大豆黄酮的生物学作用的许多实验类型的研究已经发表。这种植物雌激素是人类饮食中植物雌激素的最重要来源之一，因此，它有助于减少肥胖和糖尿病，同时还改善葡萄糖耐量和胰岛素抵抗[8，9]。 许多研究已经证明大豆黄酮具有抗氧化活性[10]。研究发现大豆黄酮对多种生理性疾病如更年期症状、心血管疾病等和骨质疏松症[11]。此外，其他研究的结果代表了该化合物对新骨形成的改善作用[12]，降低了心脏病的风险并调节了血脂代谢[13]。因为类黄酮由于其疏水环结构而具有低水溶性和生物利用度[14]，必须更多地了解它们的输送机制以及它们如何与生物聚合物相互作用。在这方面，一些研究已经使用各种实验和计算方法来检查类黄酮与转运蛋白的结合特性[15乳蛋白是生物活性小分子的天然载体[19] 。 β-乳球蛋白（ β-lactoglobulin，βLG）是牛乳中主要的乳清蛋白，分子量为18.4kDa，由162个氨基酸组成。虽然这种蛋白质的实际生物学功能尚不清楚，但它有可能作为转运蛋白发挥作用，特别是对于弱水溶性化合物[20]。几项研究表明，这种乳清蛋白对疏水性配体具有高亲和力，如类固醇、脂肪酸、类维生素A、维生素D和胆固醇[21-25 ]。βLG具有良好的生物相容性和生物降解性，可作为脂溶性药物的天然载体。此外，它还可以保护一些敏感药物免受氧化降解。因此，βLG可能* 通讯作者。电子邮件地址：najmehfani@gmail.com，n. alumni.iut.ac.ir（N.Fani）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100643接收日期：2021年5月8日;接收日期：2021年6月15日;接受日期：2021年2021年6月24日在线提供2352-9148/© 2021作者。出版社：Elsevier Ltd这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：www.elsevier.com/locate/imuE. Sattarinezhad等人医学信息学解锁25（2021）1006432++++缩略语列表ABTS（2，2′-连氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸））βLG β-乳球蛋白DMSO二甲基亚砜。EIS电化学阻抗谱FRET荧光共振能量转移GC玻碳MD分子动力学Rg回转半径均方根偏差均方根波动TroloX（6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸是类黄酮运输和保护的好选择[26]。βLG是一种杯状分子，具有用于结合配体的内腔和八链反平行β桶[27]。通过分析βLG的晶体结构发现，大多数微小的疏水配体与三个可能的结合位点之一结合; β-桶内的内腔（CALYX），β-螺旋x和β-桶之间凹槽中βLG C末端周围的表面裂缝（残基136 -149），以及Trp 19-Arg 124周围的外表面[ 28 ]。应该注意的是，这种蛋白质经历pH依赖性构象变化，并具有几种遗传变体[27]。两种最常见的βLG变体（A和B）在两个不同的点突变位点：D64G和V118A。LG中的第一个点突变发生在可移动区域，而第二个点突变发生在蛋白质的相对刚性区域[27]。尽管这两种变体之间存在结构相似性，但天然突变改变了蛋白质的功能，如净负电荷，稳定性和对小分子的结合亲和力。本文采用不同类型的光谱技术、电化学分析、分子对接和分子动力学模拟研究了大豆苷元与βLG变体A和B的相互作用的性质，并研究了大豆苷元与βLG变体A和B的抗氧化和抗癌活性。本研究揭示了该化合物在β-LG结合位点的结合机制和能力，以及其 在 生物学中的意义。这种乳清蛋白在增加大豆苷元生物利用度方面的作用此外，这两个变量的结果进行了比较和解释的基础上的结构的观点。2. 材料和方法2.1. 荧光光谱TroloX（6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸）、ABTS（2，2′-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸））、过硫酸钾、RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）、抗-otics（青霉素-链霉素）溶液，3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化盐（MTT），βLG变体A和B（纯度在两个>99%）中，购买大豆苷元和全反式视黄醇（R7632购自Sigma Chemical Company，未进一步纯化。此外，Merck还提供了二甲基亚砜（DMSO）。用于制备缓冲液的所有盐均为分析级，并溶于双蒸水中。首先通过将蛋白质溶解在含有10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）的水溶液中的在280 nm处的分子吸收系数为17，600 M-1 cm-1，考虑通过分光光度法估计蛋白质的精确浓度[29]。大豆黄酮不能溶解于水溶液中。因此，在适量DMSO中制备该化学品溶液，然后用磷酸盐缓冲液稀释至500μ M浓度。DMSO作为共溶剂的加入显著地降低了反应速率。提高溶解度，允许的溶液是尽管如此，在所用溶液中缺乏任何聚集体通过几何计量学确认以排除任何模糊性。大豆苷元溶液在使用前用氮气脱氧，所有溶液在制备后立即使用。值得一提的是，大豆黄酮的荧光量子效率在本研究的波长和浓度范围内是最小的。使用Shimadzu RF-5000荧光分光光度计（Kyoto，Japan）进行荧光研究，使用氙灯源、具有1cm光程长度的石英比色皿和水浴，所述水浴主要用于测量荧光。温度为±0.1℃。在288，293，298，在303 K下，将1.5 mL含βLG（10μM）的样品用不同体积的大豆苷元溶液（500μ M）。激发和发射狭缝的宽度各自固定在5nm。为获得峰面积，激发波长（λex）为280 nm，并在300-450 nm范围内记录荧光发射光谱。在分析结合和猝灭数据之前，针对稀释效应校正荧光强度。在所有滴定研究中，DMSO的百分比保持低于1% v/v，以避免任何共溶剂对蛋白质结构的影响。2.2. β-LG、大豆苷元及其配合物ABTS用于研究βLG、大豆苷元和βLG -大豆苷元复合物的抗氧化活性，并对之前公布的程序进行了一些修改[30，31]。在5 mM磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）中制备Trolo x（1 mM）储备溶液，并在使用前用缓冲液稀释制备新鲜的工作标准品。使用前，在水中制备ABTS储备溶液（7mM），然后与2.45mM过硫酸钾（终浓度）反应以产生ABTS自由基阳离子（ABTS.），然后将其在室温下在黑暗中孵育12-16小时（所产生的自由基在这些环境下是稳定的，并且可以使用两天）。不同浓度的样品（βLG、大豆苷元和βLG- 大豆苷元复合物），并独立地用于检测它们的抗氧化活性。为此，ABTS。用缓冲液将溶液稀释至734 nm吸光度为0.7，并在30摄氏度加入1500μ L稀释ABTS后。将溶液加入500μ L样品溶液中，混合5min后测量吸光度。使用以下公式计算样品的抗氧化剂活性ABTS。+清除（%）=（1-AS/AC）×100（ 1）其中AC是不含任何自由基清除剂的对照（空白）样品的吸光度，AS是ABTS的吸光度。 在与各种样品浓度孵育5分钟后，将溶液中的pH值测定为0.用纯物质的抗氧化活性之和与其配合物的抗氧化活性之差的百分比计算配合物的掩蔽效应。2.3. β-LG、大豆苷元及其配合物的抗癌活性如 先 前 所 述 ， 使 用 MTT 试 验 对 人 乳 腺 癌 （ MCF-7 ） 和 宫 颈 癌（HeLa）细胞系检查了不同剂量（10、50和100 μ M）的βLG、大豆苷元及其复合物的抗癌活性（RSC Adv. 6（2016）63973-63983）。将细胞在补充有10%FBS和1%抗生素溶液的RPMI-1640培养基中生长两周，并在加湿的5%CO2培养箱中保持在37℃然后收集细胞，并以104个细胞/孔的密度接种于含200μ L培养基的96孔板将细胞在相同条件下保持过夜，然后用不同的化学品处理，并在相同条件下再孵育48小时。然后取出培养基，向每个孔中加入100μL MTT溶液（培养基中0.5 mg/mL），然后将平板在37℃下再孵育4 h。弃去培养基后，加入150μ L DMSO。E. Sattarinezhad等人医学信息学解锁25（2021）1006433==F×F0加入到每个孔中以溶解甲瓒晶体，并在570 nm处测量吸光度。研究结果是三项独立研究的平均值。使用来自每个处理和对照的吸光度值的比率来计算细胞活力。2.4. 电化学分析在电化学阻抗谱（EIS）研究中，蛋白质被固定在玻碳（GC）电极上，并作为工作电极。对电极和参比电极分别由Pt丝和Ag/AgCl电极制成。实验在3.010-3 M Fe（CN）62-的溶液中进行，0.1 M KNO3作为支持电解质。在每个EIS实验之前，用氧化铝清洁和抛光工作电极，并固定新的蛋白质层。Fe中的配体浓度(II) 在 实 验 之 前 提 出 了 解 决 方 案 。 在 0.1-100 kHz 和 0.200 V vs.Ag/AgCl的范围内进行EIS分析。对于EIS分析，使用具有法拉第笼的电化学工作站（Autolab PGSTAT12）。2.5. 分子对接程序分子对接技术用于探索微小分子与蛋白质结合位点之间的相互作用，从原子水平阐明了相互作用的本质[32，33]。在这方面，AutoDock4.2.2软件包通过应用拉马克遗传算法[ 34 ]进行对接计算。分辨率为2.20nm的βLG 3D结构取自Brookhaven蛋白质数据库（PDB ID代码：LG-A和LG-B分别为4 ib 6和4 ib 9）。采用B3 LYP杂化密度泛函理论，在6-31G** 基组水平上，采用ORCA方法优化了大豆苷元的三维结构3.0.1电子结构工具，这是最好的量子化学软件包（DFT）之一[35]。在编制βLG和大豆苷元输入文件期间，将缺失的氢和气体- teiger电荷添加到系统中。2.6. 分子动力学模拟研究分子动力学模拟是克服实验方法局限性的有力工具。此外，通过比较该方法的结果并模拟特定时间内的过程行为，可以验证从实验中获得的结果[36，37]。在这项工作中使用GROMACS软件包（v 5.1.1）运行100 ns的分子动力学（MD）模拟。对于分子动力学模拟的初始结构，选择了结合能最低、对接团簇成员最多的结构。对于水分子，使用SPC水模型[39]，gromos43a1力场[38]用于估计粒子之间的力。通过插入8和7 Na+，βLG-A和βLG-B的反离子分别充电到立方BOX。使用PRODRG网络服务获取大豆苷元力场参数[40]。对于能量最小化，首先使用最陡下降法来释放冲突连接[41]。在能量最小化过程之后，结合NVT（300 K的恒定温度）和NPT（1.0 bar的恒定压力）系综以200 ps的时间段进行位置约束。远程静电和范德华相互作用分别使用粒子网格埃瓦尔德（PME）和截止方法进行处理[42]。3. 结果和讨论3.1. 大豆苷元对β-LG的荧光猝灭作用通过测定大豆苷元与LG的相互作用，在288、293、298和303 K的四个温度下，加入不同量的大豆苷元，固定浓度的LG的固有荧光的变化，类似于许多先前发表的关于配体与蛋白质结合的研究[43-45 ]。随着大豆黄酮剂量的增加，LG-A的荧光发射强度显著降低。猝灭是荧光发射强度降低的术语，其可以使用Stern-Volmer方程表征：F=1+kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]（ 2）在不存在和存在猝灭剂的情况下的相对荧光强度分别由该等式中的F0和F表示，其可以由蛋白质荧光光谱的峰面积（S和S0）代替。 KSV是kq是双分子扩散猝灭速率常数，τ0是自由生物分子寿命（τ010- 8s）[46]。荧光猝灭可以分为两种类型：动态猝灭和静态猝灭，分别由扩散和非荧光基态复合物的产生产生。通过比较不同温度下的Ksv值和确定kq值，可以确定淬火机理。当基本猝灭模式为静态时，（1）Ksv在较高温度下下降， 分子 运动 和 解离 的 基态复合物（2）的kq值大于各种生物聚合物猝灭剂的最大动力学猝灭常数（kq29 1010升mol- 1s-1）。如果蛋白质上有n个实质性结合位点，则荧光猝灭强度与静态猝灭的缔合结合常数（Ka）之间的关系可以通过以下方程解释[46]：lnF0-F=lnKa+nln[Q]（ 3）表1和表2包含猝灭数据以及Ka和n值。可以看出，Ksv的值随着温度的升高而下降，上升，而kq值大于291010 L mol-1 s-1 at所有的温度，表明静态机制控制反应。通过观察这些结果，可以推断荧光猝灭曲线、 在不同温度下βLG-A和βLG-B的ln [ Q ]如图所示。 S1和Fig. S2，分别。3.2. 热力学参数分析如上所述，在四个温度下进行荧光研究。在此温度下，大豆苷元与β-LG相互作用的热力学参数（ΔH0，ΔS0和ΔG0）为：使用以下等式进行检查：表1测定了四种温度下大豆苷元与βLG-A和βLG-B相互作用的Stern-Volmer常数（KSV）和双分子猝灭速率常数（Kq）。T（K）Ksv×10-4 M-1KQ× 10-12 M-1R2288 0.745± 0.030 0.745± 0.030 0.996βLG-A-大豆苷元293 0.506± 0.024 0.506±0.024 0.964298 0.487± 0.039 0.487± 0.039 0.997303 0.341± 0.009 0.341± 0.009 0.997288 0.486± 0.002 0.486± 0.002 0.994βLG-B-大豆苷元293 0.468± 0.001 0.468±0.001 0.969298 0.423± 0.001 0.423± 0.001 0.994303 0.395± 0.001 0.395± 0.001 0.998E. Sattarinezhad等人医学信息学解锁25（2021）1006434=-R=0∑（）（）表2计算了4个温度下大豆苷元与βLG-A和βLG-B的结合常数（Ka）、结合位点数（n）和结合热力学参数T（K）Ka×10- 4M-1nR2H0（kJ/mol）Δ ΔS0（J/mol.K）G0（kJ/mol）Δ288 2.637± 0.134 1.160±0.032 0.994-24.261 ± 0.211βLG-A-大豆苷元293 1.736± 0.110 1.158±0.042 0.969-41.835±4.138-61.021±5.140-23.956 ± 0.033298 1.397± 0.137 1.170±0.032 0.994-23.651 ± 0.035303 1.086± 0.111 1.141±0.019 0.998-23.346 ± 0.043288 1.158± 0.102 1.121±0.024 0.996-22.410 ± 0.135βLG-B-大豆苷元293 0.949± 0.013 1.080±0.017 0.994-29.274±0.861-23.834±2.917-22.291 ± 0.154298 0.758± 0.011 1.178±0.019 0.997-22.171 ± 0.243303 0.637± 0.011 1.060±0.017 0.997-22.052 ± 0.258ΔG0= -RT lnK（4）ΔG0=ΔH0-TΔS0（5）大豆苷元与β-LG之间存在着能量传递和相互作用。此外，与R0相对应的较高的r值支持了一个静态的猝灭过程，这与我们的结果一致，即Ksv随温度降低，kq显著lnK=-ΔH0+ΔS0（六）在任何温度下。RT R（J、E、R0和r的值，以及其中，K是根据等式计算的结合常数。（3）在相应的温度下，R为气体常数。考虑到EQ。 （6）、lnK对1/T的线性图提供了估算表2中列出的ΔH0和ΔS0所需的信息，并代表了反应的自发和焓驱动性质。此外--此外，负的焓变和熵变表明氢键和范德华相互作用在结合过程中是关键的[47]。3.3. β-LG与大豆苷元根据福斯特共振能量转移（FRET）理论，能量可以从作为供体的生物分子转移到作为受体的小分子。当供体的发射光谱和受体的吸收光谱重叠时，发生FRET。FRET是一种距离依赖性相互作用，因此，生物分子和小分子之间的距离（r）可以根据以下公式计算[46]：补充材料中提供了βLG的发射光谱和大豆苷元的吸收光谱。）3.4. 大豆苷元与β-LG本实验旨在寻找大豆苷元在βLG上的结合位点。在第一次试验中使用了一个使用视黄醇的竞争性实验，以观察大豆黄酮是否也与蛋白质的内层caly x结合。为此，将视黄醇以相等浓度加入到βLG和β LG-大豆苷元溶液中。大豆苷元的结合对视黄醇与caly x的结合无明显影响，说明大豆苷元与βLG的另一个位点结合。第二部分研究了酸性pH对大豆苷元与βLG结合的影响。根据Laura Ragona等人的研究，在pH 6.5以下，作为中央caly x入口的EF环处于封闭形式，并且在pH 2下3小时后视黄醇开始泄漏。48.在pH 2条件下，β LG-大豆苷元复合物的结合实验表 明 ， 在 p H2 条 件 下 ， 3 h 后 大 豆 苷 元 的 释 放 不 明 显 ， 说 明 大 豆 苷 元 不与 β L G 的 中 心 钙 结 合 。FE=1-F6=R60r6（七）在pH2下对β LG-大豆苷元复合物的结合试验大豆苷元的释放在3小时后并不显著，这表明，00+视黄醇、大豆苷元不与β-LG的中心杯X结合。总结其中，F和F0分别为存在和不存在大豆苷元时βLG的荧光强度，E为能量转移效率，R0为50%激发能转移至受体的临界距离，可通过考虑等式（8）[46]计算。R6=8。79×10-252N-4ΦJ（8）在该等式中，λ2是描述施主和受主偶极子的空间取向的因子，N是介质供体在本文中，对于βLG，α2、N和α 3分别为2/3、1.3598和0.08J是生物分子的发射光谱和小分子的吸收光谱之间的光谱重叠，其由以下等式[46]给出上述研究表明，大豆苷元与βLG的外表面结合，而不是与βLG的内腔结合。图S4显示了在3.5. β-LG偶联对大豆苷元鉴于最近发现的大豆苷元[ 49-51 ]和βLG [ 52 ]的抗氧化活性，研究人员研究了β LG-大豆苷元缀合物的活性，将其作为开发具有适用于各种用途（特别是食品工业）的新组分的潜在靶点。尽管大豆苷元和βLG都具有显著的抗氧化活性，这取决于它们的浓度，但已经报道了它们组合的令人惊讶的结果（图11）。 1 a）。关于这个F λελ λ4Δλ=∑F（λ）Δλ（九）如图所示，这部分的结果可以在以下项目中呈现1)而纯βLG的抗氧化活性随浓度的增加而增加，但3倍于纯βLG，其抗氧化活性仅提高了36%。本文记录了等摩尔浓度βLG和大豆苷元溶液的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱。βLG的发射光谱与大豆苷元的吸收光谱十分相似。使用等式（7）-（9）导出J、E、R 0和r的值。结合的配体和色氨酸残基之间的距离小于7 nm，表明很有可能JE. Sattarinezhad等人医学信息学解锁25（2021）1006435浓度的提高; 2）抗氧化活性的增强 β-LG对大豆苷元的掩蔽作用随浓度的增加而显著增强（9倍浓度时仅增强3.8%），β-LG对大豆苷元的掩蔽作用随浓度的增加而显著增强;（4）βLG的掩蔽效应，在任何特定的恒定浓度下，E. Sattarinezhad等人医学信息学解锁25（2021）1006436Fig. 1. （a）不同浓度大豆苷元、βLG-A及其复合物的抗氧化能力。(b)MCF-7和HeLa癌细胞的细胞活力百分比 在暴露于不同浓度的BLG、大豆苷元及其组合后。在不同浓度的大豆苷元下没有表现出显著差异。一般来说，β LG-大豆苷元复合物的抗氧化活性高于相应浓度的纯大豆苷元。但复合物的抗氧化活性低于纯大豆苷元和β-LG的抗氧化活性之和 ， 表明 蛋 白 质 相 互作 用 的 掩 蔽 效应 。 如 先 前 报道 的 （ Khan，Rakotomanomana，Dufour，Dangles，2011），这种导致这种非共价结合蛋白质的化合物的抗氧化活性&降低的效应可归因于βLG的掩蔽效应。大豆苷元的-OH基团与生物大分子中的氢受体基团的分子间氢键已经与这种效应相关联，其被定义为每个复合物的抗氧化活性与单个组分的总抗氧化活性之间的百分比差异。 综合以上结果，建议采用低浓度（27μM）的β-LG和大豆苷元作为配合物的抗氧化活性（68.86%）和掩蔽效应（20.98%）。随着大豆苷元浓度的增加，其抗氧化活性没有明显增强。该活性也明显高于其它含有较高浓度βLG的配合物所获得的活性。这些发现对于食品行业中的大豆黄酮用途特别有用，它们可以帮助降低成本和操作困难，并提供健康优势。3.6. β-LG络合对大豆苷元用MCF-7和HeLa两种常见的肿瘤细胞系，研究了βLG和大豆苷元及其组合的潜在抗癌活性。总体结果（图1b）表明，化合物在MCF-7细胞中比在HeLa细胞中具有更高的抗癌活性。β-LG与大豆苷元的抗肿瘤活性中等，而二者的复合物具有更高的抗肿瘤活性。50μ M的βLG和大豆苷元混合物作用48 h后，HeLa和MCF-7细胞的最大死亡率分别为38.62%和47.08%。100 μ M的β-LG和大豆苷元混合物对HeLa和MCF-7癌细胞均有明显的杀伤作用，杀伤率分别为38.57%和33.63%。根据研究结果，大豆黄酮和β-LG复合物的使用可以改善食品的质量，因为它们具有抗癌潜力。3.7. 电化学研究在Nyquist图中观察到的一个周期是由于在蛋白质固定的GC电极上的电荷转移过程。与裸GC电极相比，蛋白质层的低电导率或电化学活性导致电荷转移电阻（RCT）显著增加（如图S5所示）。 随着配体浓度的增加，观察到的较大RCT表明大豆苷元通过在GC电极上形成复合物与LG结合E. Sattarinezhad等人医学信息学解锁25（2021）1006437表面，这增加了电极的电阻。当配体浓度达到不能被蛋白质吸收的水平时，RCT降低。3.8. 分子对接研究根据热力学特征，范德华力和氢键是β LG-大豆苷元复合物形成的关键。为了更好地了解大豆苷元与β-LG分子间的结合力，本研究采用分子对接的方法对大豆苷元与β-LG分子间的结合力进行了研究。βLG-B的晶体结构与配体十二烷基三甲基铵（DTAC）有关。在这方面，在对接（DTAC）作为参比配体回到β LG-B中之后，对接（DTAC）和参比（DTAC）之间的RMSD值为1.05 μ g。从对接计算和叠加的实验数据得出的（DTAC）的结合模式显示两者之间的高度相似。这种强烈的相似性以及计算的RMSD值支持使用AutoDock4.2将配体对接至βLG。竞争结合研究结果以及酸性pH对大豆苷元与β-LG结合的影响证实了大豆苷元与β-LG的主要结合位点βLG上的蛋白质必须在蛋白质的外表面。因此，对于两种对接，以Leu140残基的C α原子为中心的60× 60 × 60点和0.375 μ m间距的网格图和200个不同的对接应用了总共25，000，000个能量评估的计算对接数据然后基于原子坐标之间的RMSD进行聚类分析，并且结构具有最低的结合能和最多的簇成员。它应注意的是，Ligplot+程序用于分析相互作用 之间 βLG 和 大豆苷元的 详细 相互作用βLG-A结合位点的大豆苷元（图2）表明，一些疏水性（Leu 143和Leu140）和亲水性残基（Lys 141、Asp 137、Arg 148和Met 145）与该分子接触。此外，大豆苷元的羰基与Met 145的氮原子形成一个氢连接，而该分子的羟基与Asp137的羰基和Arg 148的氮原子此外，该分子与蛋白质-药物复合物上的极性（His 146、Met 145、Lys 141和Arg 148）和疏水性（Ile 147、Leu 143和Leu 140）残基相互作用，以促进额外的稳定性。当比较结合能时，似乎大豆苷元对βLG-A的亲和力略高于βLG-B。3.9. MD模拟程序分子动力学模拟方法被用来深入了解蛋白质和大豆苷元的动力学行为，以及大豆苷元的最可能的结合模式，在分子动力学模拟时间。图二. 利用Ligplot+生成大豆苷元在蛋白质结合位点的结构网格表面图像，它们的结合能和抑制常数以及大豆苷元与蛋白质结合环境的示意图。仅显示了对结合更重要的残基E. Sattarinezhad等人医学信息学解锁25（2021）10064383.9.1. β-LG与大豆苷元RMSD是评价轨道稳定性的一个重要指标，以模拟的初始结构为参考，计算了蛋白质骨架原子的RMSD图3a显示了作为模拟时间的函数的蛋白质骨架原子和与大豆苷元复合的蛋白质的RMSD。可以看出，有时在MD模拟过程中的力分布是蛋白质的某些部分突然受到很大的压力，导致与平均值的强烈偏离，但计算将继续达到平衡。虽然，我们采取的平衡结构用于计算方法。βLG-A、βLG-A与大豆苷元复合物、βLG-B和βLG-B与大豆苷元复合物的RMSD曲线在80 ns左右达到稳定，分别在0.210、0.194、0.209和0.205 nm附近振荡，之后表现良好。在MD模拟过程中，回转半径用于确定蛋白质结构的紧密性（Rg）。图3b显示了作为时间函数的游离和结合形式的蛋白质的Rg。如图所示，Rg曲线在80 ns后稳定，βLG骨架原子的Rg随时间降低，这意味着βLG结构紧凑，与大豆苷元成键的蛋白质结构变得更致密。在模拟时间内，计算了大豆苷元存在和不存在大豆苷元的情况下，对大豆苷元结合起关键作用的一些必需残基的均方根波动（RMSF），以确定氨基酸残基的迁移率。这些氨基酸残基的RMSF值小于0.15 nm，并且在大豆苷元存在下有所降低，如图3c所示。因此，大豆苷元结合限制了这些残基在结合位点的灵活性。最后，在整个模拟过程中，do-dssp命令是用于分析大豆苷元存在下β LG-A和βLG-B的时间依赖性二级结构含量。大豆黄酮与β-LG相互作用后，蛋白质二级结构基本不变（图 S6）。3.9.2. 大豆黄酮图4a显示了βLG-A和βLG-B结合位点中所有大豆苷元原子的RMSD图谱。在90 ns后，与βLG-A和βLG-B相比，该分子的RMSD相当恒定，表明玉米醇溶蛋白构象在模拟时间内变化较小。测定了原子位置的RMSF，以进一步研究大豆苷元的构象变化（图4b）。该分子在模拟时间（0.115 nm）期间的限制性变化由RMSF曲线表示，这可能是由于蛋白质和大豆苷元之间发生相对稳定的相互作用。此外，大豆苷元的羟基具有最大的RMSF值，表明这些基团在结合过程中起着关键作用4. 结论本研究采用多种方法对大豆黄酮与βLG基因变异A和B的互作机制进行了研究。本文所述的荧光研究表明，大豆苷元对βLG-A和βLG-B具有很强的结合亲和力，在298 K时，其常数分别为1.39710- 4 M-1和0.75810- 4 M-1荧光实验表明：（a）Ksv值随温度的升高而减小，（b）kq值在所有温度下均大于最大动力学猝灭常数，（c）r值大于R0.所有这些发现都指向一个静态的淬火机制。竞争性分析的结果验证了大豆苷元结合位点位于βLG的外表面上。在相应浓度下，β LG-大豆苷元复合物的抗氧化活性高于纯大豆苷元。但配合物的抗氧化活性低于总的抗氧化图三. （a）RMSD（b）回旋半径（Rg）（c）在大豆苷元结合中起重要作用的氨基酸残基的RMSF，在模拟时间内，在大豆苷元不存在和存在的情况下，E. Sattarinezhad等人医学信息学解锁25（2021）1006439见图4。 （a）RMSD（b）整个模拟时间内大豆苷元所有原子的RMSF值。大豆苷元和β-LG的抗氧化活性，表明与β-LG的相互作用掩盖了其抗氧化活性。评价了纯βLG和纯大豆苷元及其组合物的抗癌活性，表明配合物的抗癌活性有所提高。电化学研究表明，大豆苷元与β-LG在GC电极表面形成络合物。分子对接研究表明，大豆苷元通过疏水作用和氢键作用与βLG外表面的极性和非极性残基结合，但与βLG-A的亲和力更强。分子动力学模拟结果表明，大豆苷元和β-LG在模拟过程中保持稳定，与大豆苷元直接作用的氨基酸残基在结合位点的变化较少。虽然βLG-A对大豆苷元的亲和力略高，但所有实验和分子模拟结果相互印证，表明两种βLG类型似乎都是有希望的大豆苷元载体。大豆苷元与β-LG络合后，其溶解性、抗癌活性及光、热稳定性均得到改善竞合利益未申报。确认我们要感谢伊斯法罕大学，特别是化学系附录A. 补充数据本文的补充数据可在https：//doi网站上找到。org/10.1016/j.imu.2021.100643。引用[1] 作者：Peter J. 风味物质：饮食中的出现和生化活性。Nutr Res 1998;18：1995-2018. https：//doi.org/10.1016/S0271-5317（98）00169-9.[2] [10]李文亮，李文亮.三种联吡啶镧系元素（III）配合物的合成、表征及与人血清白蛋白的结合评估。JBiomol Struct Dyn 2019;37.https://doi.org/10.1080/07391102.2018.1464959网站。[3] Cook NC，Samman S.黄酮-化学，代谢，心脏保护作用和饮食来源。生物化学杂志1996;7：66-76. https://doi.org/10.1016/0955-2863（95）00168-9.[4] [10]李国雄，李国雄.黄酮类化合物结构与细胞毒活性的定量关系。Hirshfeld曲面导出描述子的应用。Bioorg Med Chem Lett 2016;26：3336-41.https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2016.05.038网站。[5] ChenJ， Wu Y，ZouJ， Gao K. 显齿蛇葡萄黄酮及其衍生物的α-葡萄糖苷酶抑制和降血糖活性。Bioorg Med Chem 2016;24：1488-94.https://doi.org/10.1016/j.bmc.2016.02.018网站。[6] Mansour SZ，Moawed FSM，Elmarkaby SM. 5，7-二氢二甲砜对丙烯酰胺和γ射线照 射 大 鼠 脑 的 保 护 作 用 。 JPhotochem Photobiol B Biol 2017;175 ： 149-55.https://doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2017.08.034网站。[7] [10]李文辉，李文辉.三种新型稀土2，9-二甲基-1，10-菲咯啉配合物与人血清白蛋白相互作用的计算和实验研究。JIran Chem Soc 2018;15.https://doi.org/10.1007/s13738-018-1356-5.[8] 放大图片作者：Kritz-Silverstein D.绝经后妇女膳食中维生素E摄入与心血管疾病危险因素相关《营养学杂志》 2001;131：1202-6.[9] Abolhassani H，Bordbar AK，Fani N，Adibipour Z，Sahihi M，SattarinezhadE，Gholami S，Atrian M.β-酪蛋白纳米蛋白对肾上腺素和花生四烯酰肾上腺素生物物理影响的光谱和分子模拟探测。第149章. https://doi.org/10.1007/s00706-017-2103-9网站。[10] [10] Akaza H，Miyanaga N，Takashima N，Naito S，Hirao Y，Tsukamoto T，Mori M.大豆黄酮非代谢型前列腺癌的高风险？血清大豆异黄酮浓度的病例对照研究。Jpn JClin Oncol 2002;32：296-300. https://doi.org/10.1093/jjco/hyf064。[11] Velasquez MT，Bhathena SJ.膳食植物雌激素：在肾脏疾病保护中的可能作用。美国肾脏病杂志2001;37：1056-68. https://doi.org/10.1016/S0272-6386（05）80025-3.[12] 山口湾异黄酮与骨代谢：其细胞机制及对骨丢失的预防作用 健康科学杂志2002;48：209-22. https://doi.org/10.1248/jhs.48.209。E. 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